Molecular cloning and inhibitory characterization of papain-like cysteine protease propeptide from Calotropis procera R. Br.

Abstract

대부분의 cysteine protease는 clan CA, C1 family로 분류되는 papain-like cysteine protease에 속한다. Cysteine protease는 모든 유기체에 다양하게 존재하며 광범위한 질병과 세균, 기생충 감염의 원인으로 작용한다. 따라서 지금까지 cysteine protease에 대한 저해제의 개발이 계속해서 진행되어 왔다.

모든 papain-like cysteine protease는 공통적으로 signal peptide, propeptide, mature catalytic domain으로 이뤄진 zymogen 형태로 발현된다. Propeptide는 protease 저해제의 기능을 가지며 이를 이용한 저해제의 연구가 많이 진행되고 있다.

선행연구에서는 열대식물인 Calotropis procera R. Br.의 전사체분석을 통해 20가지의 cysteine protease를 동정할 수 있었다. 20가지의 cysteine protease의 propeptide domain(SnuCapCpI) 중 선정된 8가지를 Escherichia coli 시스템에서 대량발현하여 얻은 SnuCalCpI03, SnuCalCpI15만이 cysteine protease 저해제로 쓰일 수 있었다. 따라서 발현되지 않은 후보를 대상으로 신규 천연 소재 저해제의 확보하고 cysteine protease 중 대표적인 papain에 대하여 저해 특성을 규명하는 연구를 진행하였다.

SnuCalCpI의 저해제로의 가능성은 서열분석을 이용하여 papain의 propeptide와의 높은 상동성 및 propeptide의 구조적으로 중요한 모티프의 존재를 통해 확인하였다. 또한 SnuCalCpI 유전자의 코돈 분석을 통해 선행연구에서 발현되지 않은 SnuCalCpI08, SnuCalCpI14, SnuCalCpI17 중 SnuCalCpI08과 SnuCalCpI17에서 E. coli에서 거의 사용되지 않는 코돈인 레어코돈 비율이 상대적으로 높음을 확인하였다.

Calotropis procera R. Br.로부터 total RNA 추출을 통해 cDNA를 합성하였으며, SnuCalCpI08, SnuCalCpI14, SnuCalCpI17 유전자를 PCR을 통해 증폭시켰다. 각각의 유전자는 pET29b(+) 벡터에 삽입하여 6가지의 레어코돈의 tRNA를 제공하는 E. coli Rosetta(DE3)에 발현하였다. SnuCalCpI08과 SnuCalCpI17이 발현되었으며, SnuCalCpI17만이 soluble하게 발현되었다.

선행연구로부터 확보한 SnuCalCpI03과 SnuCalCpI15를 포함하여 SnuCalCpI17의 cysteine protease에 대한 특성 분석을 진행하였다. Papain에 대한 저해 활성을 측정한 결과, IC50은 각각 103.702±2.060 µg/mL, 23.900±0.654 µg/mL, 105.671±9.857 µg/mL이었다. 또한 SnuCalCpI는 공통적으로 papain에 대해 slow-binding 저해제로 작용하였으며, Kiapp는 각각 28.70 μg/mL, 13.63 μg/mL, 75.80 μg/mL이었다.

Slow-binding 저해제는 표적에서 해리되는 속도가 느려 생체 내에서 오랫동안 결합된 채로 유지되며, 저해제의 IC50보다 훨씬 낮은 복용량에도 효과적으로 표적을 억제할 수 있다. 또한 펩타이드 형태의 저해제는 화학적으로 합성된 저해제와 달리 고분자이지만, 입체특이적으로 단백질-단백질 상호작용을 하기 때문에 활성부위에 특이적으로 잘 결합할 수 있다. 또한 천연자원에서 유래된 생리활성 펩타이드는 신체 조직에 축적되지 않으며, 부작용에 대한 사례가 거의 없다. 따라서 천연자원 유래 및 slow-binding 저해의 특성을 지닌 SnuCalCpI는 papain-like cysteine protease에 대한 효과적인 약물 제재로 사용할 수 있음을 시사한다.

Cysteine proteases are present in all living organisms and cause a wide range of diseases as well as bacterial and parasitic infections. Therefore, much effort has been made to search for inhibitors to control cysteine protease activity. Recently, twenty kinds of cysteine proteases from Calotropis procera R. Br., which were identified by transcriptome analysis, have been reported. Based on the inhibitory activity of propeptide to their cognate enzymes, eight propeptides (SnuCalCpIs) were selected and SnuCalCpI03 and SnuCalCpI15 could be used as cysteine protease inhibitors. In this study, a novel inhibitor among SnuCalCpI08, SnuCalCpI14, and SnuCalCpI17, which were not expressed in previous studies, has been secured and the analysis on inhibitory activity and kinetics of SnuCalCpIs for papain was performed to develop inhibitor material.

cDNA was synthesized using total RNA extract from Calotropis procera R. Br., and genes of SnuCalCpI08, SnuCalCpI14 and SnuCalCpI17 were amplified by PCR. Analysis of codon usage in SnuCalCpI genes revealed that SnuCalCpI08 and SnuCalCpI17 among SnuCalCpI08, SnuCalCpI14, and SnuCalCpI17, which were not expressed in the previous studies, were found to hold 10% or more of rare codons, which were rarely used by E. coli, unlike the other inhibitor genes. Each gene was inserted into pET29b(+) vector and expressed in E. coli Rosetta(DE3) providing tRNAs for six rare codons. SnuCalCpI08 and SnuCalCpI17 were overexpressed, but only SnuCalCpI17 was expressed in soluble form.

Characterization of SnuCalCpI17 including SnuCalCpI03 and SnuCalCpI15, which have been previously obtained, was performed. According to results of papain inhibition assay, the half-maximal inhibitory concentrations (IC50) of SnuCalCpI03, SnuCalCpI15, and SnuCalCpI17 were 103.702±2.060 µg/mL, 23.900±0.654 µg/mL, and 105.671±9.857 µg/mL, respectively. SnuCalCpIs exhibited the kinetic characteristics of a slow-binding inhibition for papain, and Kiapp values were 28.70 μg/mL, 13.63 μg/mL, and 75.80 μg/mL, respectively.

Slow-binding inhibitor has the slow dissociation of inhibitor from the inhibitor-target complex, resulting in long residence time in vivo and effective inhibition of the target at doses far below the IC50 of the inhibitor. Also, high-molecular weight protein inhibitors show higher enzyme selectivity than chemical inhibitors which bind to cysteine residues at the active site due to the stereospecificity of the protein-protein interaction. In addition, peptides from natural sources do not accumulate in body tissues, and there are few reports about negative side effects. Therefore, SnuCalCpI, which was derived from natural resource and has characteristic of slow-binding inhibition, can be used as an effective inhibitor for papain-like cysteine protease.