Development of isothermal digital PCR platform for quantification of circulating tumor DNA

Abstract

Quantification of circulating tumor DNA facilitate detection of cancer without invasive detection and variables derived from characteristic of cancer patients against conventional cancer detection technique such as anti-body bio marker or tissue biopsy. For the detection and quantification of DNA biomarker, gene relate technologies are developed actively employing DNA amplification technique based on polymerase chain reaction (PCR). Especially, digital PCR specialized on quantify assay is commonly employed for research about the DNA samples which have extremely low concentration in entire liquid sample. But conventional digital PCR process generally require high cost equipment, well-trained technicians and time consuming caused by complex steps. So, the researches about microfluidic systems to substitute conventional digital PCR are on the progress in the contemporary society. In this study, a microfluidic platform that have possibility of quantification of ctDNA without high cost equipment and time consuming is through employing microfluidic systems and isothermal DNA amplification known as recombinase polymerase amplification (RPA). With isothermal DNA amplification technique, the limitations derived from conventional PCR, such as high temperature, are not remained. And also, designed microfluidic platform facilitate robust, fast and simple colony forming which is key-point of the digital PCR technics for the quantification of DNA samples. With this platform, liquid samples are easily isolated in 20,000 micro well structures with simple pressing force and generic DNAs extracted cancer cells are used to mimic actual ctDNA environment and extremely low concentration in patient blood samples. Extracted generic DNAs with mutation are detected with designed primers and probes successfully in microfluidic platform. This study provide the robust and easy-to-use microfluidic platform for quantification of ctDNA as point-of-care (POC) platform.

혈액 내 순환 종양 유전자의 정량 검출은 기존의 항체 기반 바이오마커 검사나 조직 검사에 비하여 암 검출을 침습성 검사 혹은 개개인의 환자에 따라 변수가 결정되는 일 없이 가능하다. 이러한 유전자 기반 바이오마커의 검출을 위해서 많은 유전자 관련 기술들이 중합효소연쇄반응(PCR) 기술을 기반으로 활발하게 개발되었다. 특히, 디지털 중합효소연쇄반응은 정량 분석에 특화 되어있는 기술로, 전체 표본에서 농도가 매우 낮은 유전자 표본을 검출할 때 일반적으로 사용된다. 하지만 기존의 디지털 중합효소연쇄반응 과정은 일반적으로 복잡한 과정으로 인하여 높은 가격의 장비, 숙련된 기술자 그리고 많은 시간 소모를 동반한다. 이로 인해, 기존의 디지털 중합효소연쇄반응을 미세 유체 시스템을 통하여 대체하려는 연구가 현대사회에서 진행되고 있다. 이 연구에서는 미세 유체 시스템과 재조합 효소 중합효소 증폭(RPA)라고 불리는 등온 유전자 증폭 기술을 통하여 혈액 내 순환 종양 유전자의 정량 검출을 고가의 장비와 많은 시간 소모 없이 가능한 미세 유체 플랫폼을 연구하였다. 등온 유전자 증폭 기술을 통하여 고온에서 진행되는 기존의 중합효소연쇄반응의 한계점을 해결하였다. 또한 설계된 플랫폼을 통하여 디지털 중합효소연쇄반응에서 중요한 표본의 콜로니 구성을 정확하고, 빠르며, 간단하게 진행할 수 있다. 이 플랫폼에서는 간단한 압력을 가해 유체 표본을 20,000개의 미세 웰 구조에 분리해낼 수 있으며, 또한 암세포에서 추출한 유전자를 통하여 실제 환자에서의 혈액 내 순환 종양 유전자를 모사하고, 혈액 표본에서 매우 낮은 농도를 가지는 순환 종양 유전자의 환경을 유사하게 구현하였다. 추출된 변형 유전자는 설계된 프라이머, 프로브를 이용하여 미세 유체 플랫폼에서 성공적으로 검출이 가능하였다. 이 연구에서는 이를 통하여 혈액 내 순환 종양 유전자의 정량 검출이 확실하며 사용이 용이한 플랫폼을 현장현시검사(POC) 플랫폼으로 제안한다.