Development of Film-assisted Honey Bee Egg Collection System (FECS) and Its Application to Honey Bee Genome Editing.

Abstract

Despite the huge potential of genome editing in honey bee research and breeding program, only a few successful cases of honey bee genome editing have been reported so far. With an aim of improving conventional protocol, I developed film-assisted honey bee egg collection system (FECS), which provides streamlined protocol in egg collection and microinjection procedure as well as potential applicability to other researches that require massive collection of high quality honey bee eggs. By employing FECS in honey bee genome editing to generate spinosad-resistant honey bee, I could generate mutant honey bees with their nicotinic acetylcholine receptor alpha 6 subunit (nAChR α6) knocked down in a high germline genome editing rate. To my knowledge, this is the first report of successful honey bee genome editing using Cas9 ribonucleoprotein(RNP) instead of Cas9 mRNA. Although there were problems in assessing spinosad resistance with a limited number of mutant drones, I proved that haploid honey bees without functional nAChR α6 gene can develop into adult drones, of which various phenotypes, including behavioral characteristics and spinosad resistance, can be further analyzed.

최근CRISPR-Cas9 기술의 발달에 힘입어 그 어느때보다 다양한 생명체를 대상으로 정교한 유전체 편집이 가능 해졌으며, 2016년 Kohno 등의 연구를 통해 꿀벌에서도 CRISPR-Cas9을 이용한 유전체 편집이 이루어 질 수 있음이 입증되었다. 본 연구는 기존의 꿀벌 형질전환 기술의 프로토콜을 개선하고 CRISPR Cas9 기술을 통한 살충제 저항성 꿀벌 개발에 대한 개념증명을 목표로 실행되었다. 이를 위해 필름교환식 꿀벌 알 수집 시스템(FECS)을 개발하였다. FECS는 필름면에 산란을 유도함으로써 여왕벌을 반복해서 가둘 필요가 없도록 설계되었으며 이를 통해 알 수집과정 전반이 간소화되어 작업시간 단축 및 사고방지를 통한 작업효율 향상을 기대할 수 있다. 또한 여왕벌이 산란해 놓은 배열 그대로 평평한 필름면 위에 알이 정렬되어 있으므로 마이크로인젝션을 위한 별다른 준비가 필요하지 않으며, 인젝션 과정에서 별도의 구조물에 의한 방해를 받지 않으므로 인젝션 준비 및 작업을 보다 손쉽게 할 수 있도록 한다. 또한, 뒷면에 실리콘 코팅을 적용하여 필름의 부착력을 높이고 손쉬운 탈부착이 가능하도록 하였다. FECS를 통한 꿀벌 알의 대량수집을 통해 CRISPR-Cas9기술을 이용한 꿀벌 유전체 편집을 진행하여 니코틴성 아세틸콜린수용체 알파6 서브유닛 유전자가 편집된 꿀벌을 개발하는데 성공하였다. 기존 연구에서는 Cas9 mRNA를 이용하여 진행되었으므로, 이는 Cas9 단백질 주입을 통한 꿀벌 유전체 편집으로는 최초의 보고이다. 비록 형질전환 개체수의 부족으로 정상적인 생물검정이 진행되지는 못하였으나, 알파 6 유전자가 낙아웃 된 꿀벌이 성충 수벌로 정상적으로 발생할 수 있음을 입증하였으며, 후속연구를 통해 스피노사드 저항성 및 기타 표현형을 분석할 수 있을 것으로 기대된다.