Identification of RNA silencing suppressor(s) encoded by Fusarium graminearum virus 1 that interferes with FgDICER-2 and FgAGO-1

Abstract

Fusarium graminearum virus 1 (FgV1)은 붉은 곰팡이를 감염하는 곰팡이바이러스로, 감염 시 붉은 곰팡이의 균사 생장 속도 감소 및 색소 증가, 포자형성 감소, 병원성 감소 등 표현형에 변화를 나타낸다. 선행실험에서 바이러스 감염에 대항하여 갖는 붉은 곰팡이의 RNA 간섭과 관련한 유전자인 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자의 전사량을 FgV1을 감염시킨 뒤 확인해 본 결과 붉은 곰팡이에서 분리한 다른 속에 속하는 곰팡이 바이러스인 FgV2와 FgV3를 감염시켰을 경우보다 전사량이 낮은 점과, hairpin RNA 구조로 RNA 간섭을 유도한 형질전환 붉은 곰팡이에 FgV1을 감염시킬 경우 증가 된 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자의 전사량이 감소하는 것을 확인한 바 있다. 따라서 선행 실험을 통해 FgV1은 붉은 곰팡이의 RNA간섭을 방어하는 기능을 하는 suppressor를 암호화하고 있다고 추측하였고 본 연구에서는 FgV1 감염이 붉은 곰팡이의 RNA간섭을 어떻게 방해하고, FgV1을 암호화하는 4개의 open reading frames(ORFs) 중 어떤 ORF가 suppressor로 기능하는지 밝히고자 한다. FgV1이 기주 곰팡이의 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자의 전사량을 어떻게 억제하는지를 알아보고자 FgAGO-1- or FgDICER-2-promoter/GFP-reporter expression assay를 실시하였다. 그 결과 FgV1을 감염시켰을 경우 FgAGO-1 또는 FgDICER-2 유전자의 프로모터가 발현하지 않아 바이러스를 감염시키지 않은 균주의 GFP 전사량과 비교했을 때 GFP의 전사량에는 변화가 없거나 감소하였지만 FgV2를 감염시켰을 경우 해당 유전자들의 프로모터가 발현하여 GFP의 전사량이 증가하였다. 이 결과를 통해 FgV1의 suppressor는 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자들의 promoter에 영향을 주어 전사 발현을 방해한다는 것을 확인하였다. 이후 FgV1의 suppressor를 구명하기 위해 FgV1을 인코딩하는 4개 ORF를 각각 발현하거나 hairpin RNA구조를 함께 발현하는 형질전환 붉은 곰팡이를 제작한 뒤 qRT-PCR을 통해 hairpin RNA 구조에 의해 유도된 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자의 전사량을 비교하였다. 그 결과 증가 되었던 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자의 전사량이 FgV1의 ORF2를 발현하는 형질전환 곰팡이에서 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 FgV1을 인코딩하는 ORF2가 suppressor로서 기능을 하며, ORF2는 붉은 곰팡이의 RNA간섭과 관련한 FgDICER-2와 FgAGO-1 유전자의 프로모터에 영향을 주어 전사를 방해하는 기작으로 RNA간섭에 의한 방어 기작을 억제하는 것을 확인하였다. Suppressor의 종류 및 기작이 많이 알려진 식물바이러스에 비해 곰팡이바이러스에서는 지금까지 2~3가지 종류의 suppressor가 알려져 있다. 본 연구 결과는 아직까지 구명되지 않은 붉은 곰팡이를 감염하는 바이러스인 FgV1의 suppressor를 구명하는데 중요한 기초자료가 될 것으로 사려된다.

Fusarium graminearum virus 1 (FgV1) is associated with hypovirulence traits such as reduced mycelial growth, increase pigmentation, and reduced pathogenicity in Fusarium graminearum. The transcript level of FgDICER-2 and FgAGO-1 which are RNAi components in F. graminearum accumulate lower following FgV1 infection than following infection by FgV2 or FgV3. Moreover, those RNA levels induced by GFP-hairpin RNA construct in virus-free was significantly suppressed by FgV1 but not by FgV2 or FgV3 infections. These results suggest that FgV1 encodes viral suppressor(s) of RNA silencing (VSR) against antiviral defense response of the host. To identify how FgV1 suppresses expressions of FgDICER-2 and FgAGO-1 genes, FgAGO-1- or FgDICER-2-promoter/GFP-reporter expression assay was conducted. As a result, transcript level of GFP driven by FgAGO-1 or FgDICER-2 promoter was down-regulated by FgV1-infected mutant strain while showing up-regulated expressions by FgV2-infected mutant strain. This result suggests that FgV1-encoded suppressor(s) can directly block the induction of FgAGO-1 or FgDICER-2. To determine suppressor(s) encoded by FgV1, we generated the fungal mutants expressing each ORFs of FgV1 with or without a hairpin RNA construct. Induction of FgDICER-2 and FgAGO-1 transcript levels caused by a hairpin RNA construct was suppressed in ORF2 expressing mutant compare to those of the other mutants. FgV1 ORF-specific suppressor activity, however, was not observed in plant system by an agro-infiltration assay in Nicotiana benthamiana. Taken together, this research results indicate that the ORF2 of FgV1 has RNA silencing suppression ability by interfering induction of FgDICER-2 and FgAGO-1 with promoter-dependent manner to counteract RNAi defense response in F. graminearum.