Immunomodulatory Effect of Monoclonal Antibodies against Human Immune-checkpoint Molecule, VISTA

Abstract

Immunotherapy uses the patient's immune system, unlike conventional anticancer and autoimmune disease treatments. It is characterized by less side effects and higher expected survival rate, which is attracting much more attention as a next-generation therapy. Immunotherapy can be classified into activating immunotherapy, which promotes the function of immune cells and suppressive immunotherapy, which is used to treat autoimmune diseases and GVHD by inhibiting excessive immune cell function. The molecules related with immunotherapy are immune-checkpoint molecules that regulate the immune system. In addition to PD-1/PD-L1 and CTLA-4, which are widely known as typical immune-checkpoint molecules, VISTA is also a T cell co-inhibitory molecule. This molecule controls the activation signal so that the immune system is not damaged when the T cell signal is overactive. Because these molecules are closely related to the function of immune cells, they can inhibit excessive immune activity. In addition to studies on anticancer treatments, there are many studies that can be used to treat autoimmune diseases and GVHD. It is a principle that induces suppressive immunotherapy by further stimulating the inhibitory checkpoint molecules. Therefore, VISTA was selected as a target for the treatment of various immune-related diseases, and the drug form was selected as a monoclonal antibody. The main purpose of this study was to examine the efficacy of the monoclonal antibody candidates obtained from the screening in terms of checkpoint blockade and stimulation. In this study, monoclonal antibody candidates binding to the extracellular domain of human VISTA were firstly obtained from the human synthetic scFv library by the phage display technique. Thereafter, four candidates were identified by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and flow cytometry with the ability to selectively bind to the antigen instead of the ligand. The experiment was conducted to verify the characteristics of four monoclonal antibodies. Antibodies were produced in transient expression systems and purified by affinity chromatography. To examine the antigen binding ability, flow cytometry and western blotting were performed. Through competitive inhibition ELISA, the IC50 value was determined to compete with the ligand. Inhibition of VISTA-VSIG-3 interaction and the binding ability was compared between the clones. As a result, it was determined that the developed antibodies have high productivity and purification efficiency. This demonstrates the high possibility of industrialization. In addition, the ability to specifically bind to the target antigen and to block the signal better in competition with the ligand was also excellent. In vitro CD4+ T cell assays compared the concentration of cytokine (IFN-γ) with quantitative ELISA, whether the function of the activated T cell is inhibited or not under the co-existence of the corresponding ligand and antibodies. Therefore, the monoclonal antibodies produced in this study showed a specific response to human VISTA and VISTA-dependent immunosuppressive effect in culturing with CD4+ T cells, thus confirming the possibility of suppressive immunotherapy. This suggests that T cells that are excessively activated may be suppressed and used as an autoimmune disease and GVHD treatment agent in which the function of the immune system is higher than the normal range. We will evaluate the efficacy and the dose of the drug through further animal experiments to evaluate the possibility of future antibody treatment.

면역치료는 기존의 항암 및 자가면역질환 치료와 달리 환자의 면역 체계를 이용한다. 부작용이 덜하고 기대 생존율이 보다 높은 것이 특징으로 차세대 치료법으로 큰 주목을 받고 있다. 면역치료는 면역 세포의 기능을 증진시켜 항암 치료를 시도하는 활성 면역치료와 과도한 면역 세포의 기능을 억제하여 자가 면역 질환, 장기 이식 거부 반응의 치료에 사용하는 억제 면역치료로 나눌 수 있다. 이와 연관된 분자에는 면역계를 조절하는 면역관문분자를 꼽을 수 있다. 그중 대표적인 타깃으로 널리 알려진 PD-1/PD-L1, CTLA-4 외에도 VISTA가 있는데 이들과 마찬가지로 T세포 보조억제분자이다. 이 분자는 T세포의 신호가 과하게 작용할 때 체내 면역계가 손상을 받지 않게끔 활성 신호를 제어하게 된다. 이 분자들은 면역 세포의 기능과 밀접한 관련이 있기에 이들을 통해 과도한 면역 활성을 억제할 수 있다. 항암 치료에 관한 연구와 더불어 자가 면역 질환 및 장기이식 거부반응의 치료에도 사용할 수 있다는 연구가 활발히 진행되고 있다. 억제 면역관문분자를 더욱 자극하여 억제 면역치료법을 유도하는 원리이다. 따라서 이러한 특징을 보이는 VISTA를 면역 관련 질환의 치료를 위한 타깃으로 선정하고, 약물의 형태를 단일 클론 항체로 선정하였다. 그 후, 스크리닝을 통해 얻은 후보물질이 억제 면역관문분자 차폐와 자극 중 어떠한 효능을 보이는지 살펴보고 특성을 검증하는 것이 이 연구의 주된 목적이다. 본 연구는 파지 디스플레이 기법으로 인간 합성 단일 사슬 항체조각 라이브러리에서 VISTA의 세포 바깥 부분에 결합하는 후보들을 일차적으로 선별하였다. 그 후 경쟁적 억제 효소 결합 면역 침강 분석법 및 유세포 분석을 통해 리간드 대신 항원에 선택적으로 결합하는 능력이 큰 후보물질을 최종 각 4개씩 발굴하였다. 그리고 제작한 항체의 특성 검증을 위한 실험을 진행하였다. 일시적 발현 시스템에서 항체를 생산하고 친화성 크로마토그래피법으로 정제하였다. 항원 결합 능력을 살펴보기 위해 유세포 분석 및 웨스턴 블로팅으로 확인하였다. 경쟁적 억제 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해서는 리간드와 경쟁하며 이들의 신호전달을 얼마나 차단하는지 IC50를 구해 각 클론 간에 비교하였다. 그 결과, 개발한 항체가 생산성과 정제 효율이 좋아 산업화의 가능성이 높음을 확인하였다. 또, 타깃에 특이적으로 결합하며 리간드와의 경쟁에서 우위를 선점하는 신호 차단 능력도 우수하였다. 체외 T세포 배양을 통한 효능 평가 실험은 활성 T세포의 기능이 해당 리간드와 항체의 존재 하에 활성 상태가 억제되는지, 유지되는지를 분비되는 인터페론 감마의 농도를 정량 효소 결합 면역 침강 분석법으로 비교하였다. 따라서, 본 연구에서 제작된 단일클론항체가 VISTA에 대해 특이적인 반응을 보이고, 실제 T세포와의 배양에서 VISTA-의존적 면역억제효과를 보이므로 억제 면역치료제로서 가능성이 있음을 확인하였다. 이를 통해 과도하게 활성화된 T세포를 억제하여 면역계의 기능이 정상 범위보다 크게 올라간 자가면역질환 및 장기이식거부 반응 치료제로 이용될 수 있음을 제시한다. 추가적인 동물실험을 통해 효능 평가 및 투여 용량을 결정하여 향후 항체치료제로의 가능성을 평가하고자 한다.