인간 제대정맥 내피세포의 산소-포도당 결핍과 재산소화 과정에서의 칼리스타틴의 역할

Abstract

Introduction: Reactive oxygen species (ROS) are chemically reactive materials produced by the partial reduction of oxygen and overproduction of ROS induces oxidative stress. Ischemia-reperfusion injury (IR injury) plays an important role in neurologic deficit following cardiac arrest and oxidative stress acts as the main mechanism of IR injury. Kallistatin is an endogenous protein inhibiting tissue kallikrein activity with the property of anti-oxidation and anti-inflammation. In the previous study, association between low serum kallistatin level and poor neurological outcome of out-of-hospital cardiac arrest survivors was revealed. This study was performed to assess the antioxidant mechanism of kallistatin on the prevention of IR injury. Methods: We transfected Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with small interfering RNA (siRNA) of SERPINA4 gene which expresses kallistatin protein. After producing the SERPINA4 knock-down cells, the expression level of kallistatin was measured. To induce IR injury, SERPINA4 knock-down cells and control cells were exposed to 90 minutes of oxygen-glucose deprivation (OGD) followed by 22.5 hours of reoxygenation (OGD/R) and cell viability assay was performed. Also we measured total nitric oxide (NO) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) level and compared them between the SERPINA4 knock-down cells and control group cells. Results: SERPINA4 siRNA transfection suppressed kallistatin expression. Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation reduced cell viability and SERPINA4 knock-down cells showed more prominent reduction in cell viability compared to the control group cells. However, SERPINA4 suppression did not show significant effect on NO and eNOS expression change induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation. Conclusion: SERPINA4 knock-down enhanced cell death induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation while not affecting NO and eNOS expression change. These results are likely to be associated with the eNOS activation property of Kallistatin.

서론: 활성산소물질(reactive oxygen species)은 산소의 불완전 환원에 의해 생성되는 화학적 활성을 지닌 물질로 과다 생성되면 산화 스트레스를 유발한다. 심정지 이후의 신경학적 결손의 발생에 신경계의 허혈-재관류 손상이 주요 기전으로 작용하며 이에는 산화 스트레스가 중요한 역할을 한다. 칼리스타틴(Kallistatin)은 칼리크레인(Kallikrein)의 기능을 억제하며 항산화, 항염증 성질을 지닌 체내 단백질이다. 우리는 이전 연구에서 병원 밖 심정지의 불량한 신경학적 결과와 낮은 혈장내 칼리스타틴 농도가 연관성이 있다는 사실을 밝혀냈다. 본 연구는 허혈-재관류 손상의 예방에 있어 작용하는 칼리스타틴의 항산화 기전을 알아보기 위한 목적으로 시행되었다. 방법: 사람 제대정맥 내피세포에 칼리스타틴 유전자인 SERPINA4 에 대한 small interfering RNA 형질주입을 시행하여 SERPINA4 발현억제 세포를 만들었고 이후에 칼리스타틴의 발현정도를 측정하였다. 허혈-재관류 손상을 유발하기 위해 SERPINA4 발현억제 세포와 대조군 세포에 90분의 산소-포도당 결핍 후 22.5시간의 재산소화 처리를 하였고 세포생존분석을 시행하여 비교하였다. 또한 SERPINA4 발현 억제 세포와 대조군 세포에 대해서 총 nitric oxide (NO)와 endothelial nitric oxide synthase (eNOS) 농도를 측정하여 비교하였다. 결과: SERPINA4 siRNA 형질주입은 칼리스타틴의 발현을 억제하였다. 산소-포도당 결핍과 재산소화는 세포생존을 감소시켰으며 SERPINA4 의 발현 억제는 세포 생존 감소 효과를 더욱 두드러지게 하였다. 하지만 SERPINA4 의 발현 억제는 산소-포도당 결핍과 재산소화에 의한 NO 와 eNOS 의 발현 변화에는 유의미한 효과를 보이지 않았다. 결론: SERPINA4 발현억제는 산소-포도당 결핍과 재산소화 노출에 의한 세포사멸을 증가시켰으나 산소-포도당 결핍과 재산소화에 의한 NO 와 eNOS 의 발현 변화에는 유의미한 영향을 미치지 않았다. 이는 칼리스타틴에 의한 eNOS 발현 촉진 효과와 연관된 것으로 보인다.