Efficient sorting of human mesenchymal stem cells by enhanced hydrodynamic filtration coupled with spiral microfluidics

Abstract

척수 유래 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)는 낮은 면역원성과 자가재생능 및 다분화능으로 인해 세포 기반 치료의 의료적 용도에 있어서 몇몇 우월한 특성을 가지고 있다. 연구에 따르면, 인간 중간엽 줄기세포는 크기에 따라 다른 자가재생 및 다분화능을 보이는, 신속 자가 재생 능력을 가진 RS (rapidly self-renewing) 세포, 섬유아세포 (fibroblastic)의 형태를 가진 길쭉한 형태의 SS (spindle-shaped) 세포, 그리고 크고 납작한 형태의 FL (flattened) 세포로 구성되어져 있다. 그러므로, 더 높은 자가재생 및 분화능을 보이는 특정 크기의 중간엽 줄기세포를 분리하는 것은 세포치료의 효과를 극대화할 수 있는 유용한 방법이다. 우리는 어떠한 특이적 세포 손상 없이 나선형 미세유체와 결합된 다층의 수력학적 여과 칩을 통해 중간엽 줄기세포를 사이즈에 따라 분리하였다. 이전 연구에서는, 연속적이고 수동적인 분리방법으로서, 최적화한 채널 디자인을 통해 여러 개의 가지 채널을 가진 수력학적 여과칩을 보고하였다. 본 연구에서는, 분리 효율과 처리 속도를 보다 향상시키기 위해, 미세역학적 여과 칩에 관성 집중 효과를 이용한 나선형의 분리기를 적용하였다. 우리는 보고된 것과 같이, 신속 자가 재생 능력을 가진 RS (rapidly self-renewing) 세포(< 23 μm), 섬유아세포(fibroblastic)의 형태를 가진 길쭉한 형태의 SS (spindle-shaped) 세포(23-35 μm) 그리고 크고 납작한 형태의 FL (flattened) 세포 (> 35 μm) 의 세 가지 세포군으로 분리하였고, 이전의 연구보다 향상된 분리 효율을 달성하였다. 뼈세포와 지방세포 분화 결과는 또한 세 가지의 세포군의 성공적인 분리를 암시하였다

RS 세포군과 SS 세포군은 미분리 세포군과FL 세포군보다 높은 자가재생 및 다분화능을 확인하였다. 더불어, 줄기세포 특성을 확인하기 위해, 각 출구로부터 분리되어 나온 세포군의 표지 마커를 분석하였다. 나선형 출구와 미세역학적 여과 출구 1로부터 얻어진 세포는 CD73, CD90, CD105의 표지 마커가 동시에 발현됨을 확인하였으나, 미세역학적 여과 출구 2 로부터의 세포는 다른 세포들보다 낮은 다분화능과 함께, 줄기세포 특성을 보다 잃은 상태임을 확인하였다. 제안된 미세유체 분리 칩은 줄기세포 특성의 정도에 따른 중간엽 줄기세포의 성공적인 분리를 보여주었고, 이 방법을 통해 줄기세포 치료의 효율성을 증가시킬 수 있다는데 의의가 있다.

Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs) show several superior properties for clinical use in cell-based therapies because of their low immunogenicity, multipotency, and self-renewal capacity. According to several studies, hMSCs are heterogeneous, with different self-renewal and multipotent capacities: rapidly self-renewing (RS) cells, spindle-shaped (SS) cells, and flattened and large (FL) cells. Therefore, sorting a specific hMSC subpopulation with high self-renewal and multipotent capacities is useful to enhance the effectiveness of cell therapy. We separated hMSCs depending on size using a double layered Dean flow-aided hydrodynamic filtration (HDF) chip without any critical cell damage. As a continuous and passive sorting method, we previously reported the HDF microfluidic chip having straight multi-branch channels with optimally designed channel dimensions. In this study, to improve sorting efficiency and throughput, spiral geometry (centrifugal microfluidics) in the upper layer as an additional sorter using the inertial focusing effect was applied to the lower layer of the HDF microfluidic chip. The hMSCs were sorted into three subpopulations: rapidly self-renewing (RS) (< 23 μm), spindle-shaped (SS) (23-35 μm), and flattened (FL) (> 35 μm) cells. Higher purity and recovery were achieved compared to our previous results. The results of osteogenic and adipogenic differentiation also suggested successful fractionation of the three subpopulations

RS and SS subpopulations showed higher self-renewal and multipotent capacities than those of unsorted and FL subpopulation. Furthermore, we analyzed the surface marker expression of sorted subpopulations from each outlet to confirm stem cells characteristics. The enriched cells from the spiral outlet and HDF outlet 1 show simultaneous expression of CD73, CD90, and CD105. However, the HDF outlet 2 cells have CD90 and CD05 expression but not CD73 expression. This result demonstrates that cells collected from HDF outlet 2 lose their stem cell characteristics with lower multipotency compared to the others. The proposed microfluidic sorting chip indicated successful fractionation of hMSCs by size and stem cell characteristics, which can increase the efficiency of stem cell-based therapies.