Verification of the usefulness of anti-AQP5 autoantibodies as a biomarker for Sjögren's syndrome

Abstract

1. 목 적 쇼그렌 증후군은 구강건조증과 안구건조증을 주 증상으로 하는 질병으로 자가면역반응에 의해 침샘과 눈물샘의 기능저하가 발생한다. 현재 쇼그렌 증후군의 진단 기준에는 질병의 원인을 설명하고 질병의 활성을 반영하는 진단마커가 없다. 아쿠아포린5는 침샘과 눈물샘의 선세포(acinar cell) 및 도관세포(duct cell)에 발현하는 물통로단백질로 물분자가 지질성분인 세포막을 통과하는 통로를 제공한다. 아쿠아포린5가 결핍된 생쥐는 타액분비가 크게 감소하는 것이 보고된 바가 있다. 이전 연구에서 쇼그렌 증후군 환자 혈청에서 항-아쿠아포린5 자가항체를 발견하였고 이는 낮은 비자극 타액분비율과 연관이 있었다. 항-아쿠아포린5 자가항체의 바이오마커로서의 유용성을 검증하기 위해서는 독립적인 쇼그렌 증후군 환자 코호트에서 관찰이 이루어져야 하고 선행연구에는 포함되지 않은 질환 대조군으로 다른 자가면역질환 환자에서 항-아쿠아포린5 자가항체의 존재 여부를 확인해야 한다. 본 연구의 목적은 질환 대조군을 포함한 단면연구에서 항-아쿠아포린5 자가항체의 특이성과 민감도를 산출하고 항-아쿠아포린5 자가항체와 쇼그렌 증후군 임상지표 간의 연관성을 조사하는 것이다. 또한, 항-아쿠아포린5 자가항체 검출에 있어서 간접면역형광법과 새로이 개발된 효소면역분석법의 효율을 비교하고자 한다. 2. 방 법 쇼그렌증후군 환자(n=111)의 혈청과 질환 대조군으로 전신성 루프스 환자(n=35)와 류마티스 관절염 환자(n=35)의 혈청, 비 자가면역질환 환자의 혈청(n=43)을 이용하여 실험을 진행하였다. 아쿠아포린5의 세포 외 부분인 Loop A, Loop C, Loop E 서열로 비오틴을 붙인 펩타이드를 제작하여 이에 결합하는 환자 혈청의 IgG의 양을 효소면역분석법를 통해 측정하였다. 또한 세포기반 간접면역형광법을 사용하여 자가항체를 검색하였다. 아쿠아포린5를 과발현하는 MDCK세포와 발현하지 않는 세포를 섞어 커버슬립에 배양 후 배양된 세포를 고정하고 항원의구조를회복시키는과정을거쳤다. 항-아쿠아포린5 항체와 실험군 또는 대조군 혈청으로 염색 후 각각의 일차항체를 다른 색의 형광이 부착된 이차항체로 염색하여 공초점주사현미경으로 관찰하였다. 항-아쿠아포린5 항체로 염색된 세포를 무작위로 선택해 사진을 찍은 후 사람 IgG에 의한 염색 양상을 사진 찍어 염색된 형광강도를 측정하였다. 실험군과 대조군에서 얻어진 항 아쿠아포린-5 자가항체 값에 대해 receiver operating characterisitic (ROC) 분석을 통해 쇼그렌 증후군에 대한 민감도와 특이도를 산출하고 쇼그렌 증후군 환자군 및 건조증 대조군에서 항-아쿠아포린5 자가 항체의 존재와 타액분비율 간의 연관성을 분석하고 항-아쿠아포린5 자가항체 존재와 기타 임상지표나 검사결과와의 연관성을 분석하였다.

3. 결 과 그동안 쇼그렌 증후군의 진단에 사용되는 혈청학적 검사 (항-SSA, 항-SSB, 항핵 자가항체)는 쇼그렌 증후군 특이적이지 않고 다른 자가면역질환에서도 빈번하게 검출되기 때문에 추가 검사를 필요로 한다. 본 연구에서는 새로이 개발된 효소면역분석법을 통해서 자가항체를 측정하였고, 간접면역형광법으로 자가항체를 측정하였다.

3. 결 론 아쿠아포린5 자가항체를 통해서 구강건조증환자를포함하는비자가면역대조군과쇼그렌 증후군 환자를 구분하기에는 부족함을 느끼지만 다른 자가면역 질환 환자와는 특이성을 보였다. 아쿠아포린5 자가항체가 기존의 쇼그렌 증후군 진단 마커를 대체 할 수는 없지만, 다른 자가면역질환과 구분할 수 있는 바이오마커로 활용할 수 있을 것이다.

Background Sjögren's syndrome (SS) is a chronic inflammatory autoimmune disease characterized by dryness of mouth. A pathogenic feature of SS is characterized as polyclonal B cell hyperactivity evidenced by hypergammaglobulinemia and multiple autoantibodies, that include anti-Ro/SSA and anti La/SSB. Main components of diagnostic criteria consist of histological examinations of minor salivary glands for lymphocytic infiltration (focus score) and serology. However, presence or extensiveness of lymphocytic infiltration in salivary glands does not always indicate disease severity or degree of secretory dysfunction. SS is greatly under-recognized in clinical practice, mostly due to diverse symptomatic expressions making the initial diagnosis difficult. In fact other potential factors that contribute to SS dryness are currently under investigation. Antibodies to AQP5 have been proposed to contribute to secretory dysfunction in SS. Previous studies have identified the presence of autoantibodies to AQP5 in the sera from SS. Although the anti-AQP5 autoantibodies were also detected in control sera, the levels of anti-AQP5 IgG were significantly higher in the SS samples (n=112) than in the healthy control samples (n=53) with sensitivity of 0.73 and a specificity of 0.68. The identification of disease associated biomarkers will therefore help to clarify the complex pathogenesis of SS.

Methods A Case-controlled cross-sectional study was performed using sera from primary SS patients (n = 111 from SICCA cohort), non-autoimmune controls (NA, n = 43 from SICCA cohort) and autoimmune controls (n = 35 for RA patients and n = 35 for SLE patients). The presence of anti-AQP5 autoantibodies was screened using a cell-based indirect immunofluorecence (IIF) assay and ELISA assay.

Results By IIF using patients serum alone, the screening of anti-AQP5 IgG in SS and NA groups resulted in sensitivity of 0.595 and specificity of 0.721. Pre-incubation of serum with epitope peptide E1 improved both sensitivity and specificity, resulting in 0.613 and 0.767, respectively. To establish the best screening method for anti-AQP5 autoantibodies, ELISA assay technique was used. Using the assay, 224 sera were evaluated. As results, the levels of anti-AQP5 were significantly higher in the SS patients than other autoimmune disease patients with sensitivity of 0.856 and specificity of 0.707 detected by ELISA using peptide E1. Using peptide A, sensitivity and specificity were 0.892 and 0.637 respectively, excluding the case of RA and SLE. However the combination of three peptides did not improve the assay sensitivity nor specificity significantly. The detection of anti-AQP5 was analyzed in comparison with clinical parameters used for SS diagnosis. ANA was significantly associated with anti-AQP5 frequency in SS group (detected by ELISA). However there were no significant associations or only weak associations between anti-AQP5 autoantibodies and SS diagnosis factor.

Conclusion Further studies are needed to conclude the comparison in performance of AQP5 marker to existing SS diagnose marker. Yet this study may be contributed to further development in improving diagnostic assays for diagnosis and treatment of SS.