One-Step Generation of a Drug-Releasing Microarray for High-Throughput Small-Volume Bioassays

Abstract

고속처리탐색 (high-throughput screening, HTS) 기술은 수천 가지 화합물의 반응을 동시에 분석하여 많은 수의 후보물질 가운데 원하는 물질을 찾아내기 위한 기술로, 신약개발을 포함하여 광범위한 생명공학, 화학 관련 분야에서 활용되고 있다. 하지만 96웰 플레이트와 같은 기존의 고속처리탐색 플랫폼은 엄청나게 많은 양의 시약과 그에 따른 높은 비용을 필요로 하기 때문에 대형 제약사나 대규모 연구기관 등 제한된 환경에서만 활용이 가능했다. 고속처리탐색에 필요한 비용을 낮추기 위해 플랫폼의 소형화가 이루어져 왔는데, 최근에는 마이크로 공정기술을 적용한 랩온어칩 (lab-on-a-chip) 플랫폼이 고속처리탐색에 활용되고 있다. 플랫폼의 소형화는 비용절감의 장점뿐만 아니라 제한된 양의 샘플을 이용해서 많은 후보물질을 탐색할 수 있다는 장점도 가지기 때문에, 줄기세포나 환자유래세포 등 희귀샘플을 대상으로 고속처리탐색 기술을 활용할 수 있게 해준다.

하지만 지금까지 고속처리탐색기술의 활용이 제한적이었던 것은 많은 양의 샘플과 시약 소모 외에도, 수천 가지 이상의 서로 다른 물질들을 탐색하기 위해서 반드시 필요한 고가의 자동화 파이페팅 로봇이 원인이 되었다. 이러한 문제를 해결해보고자 대규모 마이크로어레이의 상향식 생성방법에 기반을 둔 파이페팅이 필요 없는 (pipetting-free) 고속처리탐색 기술의 개발이 시도되어 왔지만, 고속처리탐색에 필수적인 요소인 여러 종류의 서로 다른 약물을 상호오염 없이 동시에 다루는 것에는 어려움이 있었다.

본 논문에서는 서로 다른 약물을 함유한 코드화된 미세입자의 자기조립을 통해 파이페팅 없이 대규모 약물 마이크로어레이를 생성할 수 있는 기술과 이를 고속처리탐색에 활용할 수 있는 플랫폼을 개발하였다. 한번의 파이페팅으로 수천 개의 약물함유 미세입자를 기판 위에 전달하고, 이 미세입자들을 기판 위의 미세우물 (microwell) 들에 자기조립 함으로서 수천 번의 파이페팅을 대체할 수 있다. 무작위로 조립된 미세입자들이 각각 어떤 약물을 함유하고 있는지 입자 위의 코드를 해석함으로써 알 수 있는데, 이를 위해 인공신경망 (Artificial Neural-Network)을 이용한 코드해석 프로그램을 개발하였다. 몬테카를로 (Monte-Carlo) 시뮬레이션을 통해 하나의 칩 위에서 얼마나 많은 약물후보를 테스트해볼 수 있는지 계산할 수 있는 방법을 제시하였으며, 편리하고 신뢰성 있는 실험을 위해 폴리스티렌 칩과 지그 시스템을 개발하였다. 특히 하이드로겔 기반의 미세입자로 많은 양의 약물을 균일하게 전달할 수 있도록 하기 위하여 동결건조 기반의 약물로딩 방법을 개발하였다. 이 방법은 용매의 종류에 상관없이 용액 속에 녹아있던 약물 분자를 모두 미세입자에 로딩할 수 있기 때문에, dimethyl-sulfoxide (DMSO) 등의 유기용매를 사용하여 불수용성 (water-insoluble)의 약물도 다량 전달할 수 있었다.

본 논문에서는 제안된 플랫폼을 이용하여 순차조합 약물의 스크리닝을 수행하였다. 최근 약물의 순차조합이 세포 내 경로를 동적으로 재배열할 수 있어서 단순 약물조합보다 더 효과적으로 암세포를 치료할 수 있음이 밝혀지고 있는데, 제안된 플랫폼을 이용하면 약물 칩을 교체하는 것 만으로 쉽게 수천 개의 순차조합 약물을 테스트 해볼 수 있었다. 항암치료가 어려운 암으로 알려져 있는 triple negative breast cancer (TNBC)를 대상으로 효과적인 항암효과를 보이는 EGF 수용체 억제제와 제노톡신 (genotoxin)의 순차조합을 찾아내었으며, 가장 좋은 효과를 보였던 erlotinib과 mitoxantrone의 조합을 대상으로 용량-반응 매트릭스 (dose-response matrix)를 통해 그 시너지효과를 분석하였다.

정리해보면, 본 연구에서 제시한 플랫폼은 다음과 같은 의의를 가진다. 우선 작은 용량을 사용하는 고속처리탐색기술로서, 시약의 값이 너무 비싸거나 샘플의 양이 제한적이어서 기존의 고속처리탐색 플랫폼으로는 수행이 불가능했던 일을 가능하게 해준다. 환자유래세포를 사용하는 약물탐색이나 유전자발현량 분석 (gene-expression profiling) 등으로 탐색결과를 읽고자 하는 경우 등이 대표적이며, 이러한 장점은 소형화된 랩온어칩 플랫폼들과 공통적으로 가지는 장점이다. 두 번째는 자동화된 액체처리기의 필요성을 없앰으로써 고속처리탐색의 접근성과 활용성을 높인 것이다. 이는 고속처리탐색기술이 개별연구실 단위에서 보다 다양한 학술적 연구에 활용되거나, 각 병원에서 환자맞춤형 치료에 활용될 수 있는 가능성을 열 수 있다. 이런 장점들로 인해 지금껏 제한된 조건에서만 사용되어 오던 고속처리탐색기술의 활용범위를 넓힐 수 있으리라 기대한다.

High-throughput screening (HTS) is a technology for simultaneously analyzing the reaction of thousands of compounds to find the desired substance among a large scale of substances library. It is used in a wide range of biotechnology and chemical-related fields, including drug development. However, conventional HTS platforms such as 96-well plates require enormous amounts of reagents and thus high cost, so they can only be used in limited environments such as large pharmaceutical companies or large research institutions. HTS platforms have been miniaturized to reduce the experimental cost, lab-on-a-chip techniques have recently applied to develop small-volume HTS platform. The miniaturization of the HTS platform has the benefit of cost reduction, as well as the advantage that many drug candidates can be tested with a limited amount of samples. Therefore, it is possible to utilize HTS technology for rare sample screening such as stem cells or patient-derived cells.

However, the limited use of HTS was not only because of a large amount of samples and reagents but also of the high price of a robotic pipetting machine that is essentially needed to handle thousands of different substances. To address this problem, several attempts have been tried to develop a pipetting-free HTS platform based on a bottom-up generation method of a large-scale microarray, but it was difficult to handle thousands of heterogeneous drugs simultaneously without cross-contamination.

In this paper, pipetting-free HTS platform based on the formation of large-scale drug microarray by self-assembly of encoded drug-laden microparticles has been developed. With a single pipetting, thousands of drug-laden microparticles can be transferred onto a substrate and self-assembled into microwells on a substrate. This one-step pipetting of microparticles can substitute thousands of pipetting. From the randomly assembled microparticles, which drug is treated on which microwell can be identified through reading the code on the microparticle with the neural-network-based decoding software. How many drug candidates can be tested on a single chip was statistically analyzed by Monte Carlo simulation, and polystyrene chips and jig systems were developed for convenient and reliable experiments. In particular, a freeze-drying based drug loading method was developed to uniformly deliver a large amount of drug with hydrogel based microparticles. Because this method can load all the dissolved drug molecules into the microparticles regardless of the solvent type, water-insoluble drugs are also deliverable by using an organic solvent such as dimethyl-sulfoxide (DMSO).

Screening of sequential drug combination was demonstrated using the proposed platform. Recently, it has been shown that a sequential combination of drugs can dynamically rearrange the intracellular pathway and thus treat cancer cells more effectively than simultaneous drug combinations. Using the proposed platform, it was easy to test thousands of sequential combinatorial drugs just by replacing the drug chips. Sequential combinations of EGFR inhibitor followed by genotoxin were tested against triple negative breast cancer (TNBC). The combination of erlotinib and mitoxantrone were the most effective pair, and their dose-response matrix was obtained to analyze their synergism.

In summary, the platform presented in this study has the following significance. First of all, this small-volume HTS platform makes available to do the experiments which were impossible with conventional HTS platforms due to the limited amount of samples and too much reagent consumption. Second, by eliminating the need for an automated liquid handler, it improves the accessibility and usability of HTS platform. This can open the possibility that HTS technology can be applied to various academic investigations in individual laboratories or personalized medicine in the hospitals.