Regulation of human embryonic stem cell fate via generation of size-controlled human embryoid bodies using magnetic nanoparticles

Abstract

인간배아체(human embryoid bodies, hEBs)로 구현하여 분화를 유도하는 것은 실제로 체내에서 일어나는 배아의 발생 과정(embryogenesis)과 상당부분 유사점을 가지고 있다. 이 때문에, 인간배아체는 인간의 배아 발생 과정에 대한 이해 및 통찰을 돕는 데 적합한 도구로서 이용되고 있다.

본 연구에서는 먼저, 세포 투과성(cell-penetrating) 자성나노입자(magnetic nanoparticles, MNPs)를 이용하여 인간배아체를 정해진 크기로 제작하였다. 그리고 이렇게 구현된 인간배아체의 분화 양상을 분석하였다. 그 과정에서 충분한 양의 자성나노입자를 인간배아줄기세포 안쪽으로 도입하기 위해, 피더(feeder)라고 하는 도움 세포와 함께 배양되던 인간배아줄기세포를 피더가 없는 환경에서 배양하도록 개선하였다. 그리고 자성나노입자의 도입에 의해 자화 된(magnetized) 인간배아줄기세포를 부유 시켜, 자성 핀(pin) 기반의 집중된 자기력 시스템(concentrated magnetic force system)에 넣어 줌으로써 효과적으로 인간배아체로 뭉치도록 유도하였다. 이 때, 집중된 자기력 시스템의 한 개의 웰(well)에 넣어주는 세포의 개수를 조절함으로써 제작하는 인간배아체의 크기를 조절할 수 있었다. 인간배아체를 부유하는 상태로 3일간 배양한 결과, 크기가 작은 인간배아체(지름 150 μm)에서는 외배엽성 분화(ectodermal differentiation)가 증진되고, 크기가 큰 인간배아체(지름 600 μm)에서는 내배엽 및 중배엽성 분화(endodermal and mesodermal differentiation)가 증진된 것을 확인하였다.

크기가 조절된 인간배아체가 자발적으로 분화되도록 유도하는 과정에서, 작은 크기의 인간배아체 중 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 염색에서 양성을 띄었던 일부 세포가 신경 돌기(neurites)를 뻗어내는 것과 같은 양상을 보였다. 실제로 많은 연구자들이 인간배아체를 가지고 신경 분화를 시키고자 연구해오고 있는데, 그 이유는 인간배아체의 탄성(elasticity)이 뇌의 조직 탄성과 비슷하고, 나아가 인간배아체에서 증진되는 세포 간 상호작용력이 실제 신경세포의 그것과 유사하기 때문이다. 이 연구에서는 앞서 제작한 작은 크기의 인간배아체를 보다 증진된 방향으로 신경 분화 시키기 위해서 신경유도배지(neural induction medium, NIM)를 5일간 사용하였다(Ⅳ). 그리고 다른 3개의 대조실험군을 설정하여 신경 분화의 증진 정도를 비교하였다

분화시키지 않아서 분화능을 유지하고 있는 인간배아줄기세포(Ⅰ), 신경유도배지를 이용해 5일간 분화시킨 인간배아줄기세포(Ⅱ) 그리고 신경유도배지와 자성나노입자를 사용해 5일간 분화 유도한 인간배아줄기세포(Ⅲ). 다른 실험군과 비교하여 신경 분화를 유도한 작은 크기의 인간배아체에서 통계적으로 유의미한 신경 유도의 증진 현상이 관찰되었다. 더불어, 자성나노입자가 신경유도배지와 함께 쓰였을 때, 신경 유도를 증진하는 효과가 있는 것으로 드러났다. 그리고 Ⅳ에서 증진된 신경 유도를 설명하는 신호 기전을 확인하고자 몇몇 단백질의 발현 여부를 추가적으로 확인하였다. 대표적인 단백질로는, 윈트(WNT) 단백질, 도파민반응성 신경 관련 단백질, 세포 간 상호작용과 관련된 단백질 그리고 메카노트랜스덕션(mechanotransduction) 관련 단백질이 있다.

종합하자면, 필자는 본 연구에서 자성나노입자를 이용해 인간배아체를 효과적으로 구현하고 그것의 크기를 자유자재로 조절하는 기술을 고안하였다. 그리고 이 기술을 이용하여 인간배아줄기세포의 초기 분화 방향을 결정하는 중요한 요소 가운데 하나로서 인간배아체의 크기가 있다는 사실을 확인 할 수 있었다. 나아가, 크기가 작은 인간배아체를 구현하여 신경 유도를 시키는 연구로 심화하였는데, 신경 분화가 효과적으로 증진되어 결과적으로는 초기 신경 유도에 걸리는 시간을 대폭 단축할 수 있었다. 그리고 이 과정이 윈트(WNT) 신호전달체계 및 도파민성 신경신호전달체계를 따른다는 것을 확인할 수 있었다. 나아가, 이 같은 결과가 자성나노입자 기반의 인간배아체 구현 기술에서 기인하는 세포 간 상호작용력 증진 및 메카노트랜스덕션(mechanotransduction)에 의한 것임을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 제안한 자성나노입자를 이용해 인간배아체의 크기를 조절하는 방법은 인간배아줄기세포의 특성화된 분화(lineage-specific differentiation) 유도 및 그를 통한 세포의 운명(fate) 결정에 매우 유용하고 가치 있는 기술이라고 할 수 있다. 이 기술을 이용해 인간배아줄기세포를 보다 다양한 종류의 세포로 분화 유도 할 수 있다면, 조직공학적 응용이 가능할 것이며 나아가 인간 배아의 발생과정을 모사하는 데 의미 있게 쓰일 수 있을 것이다.

Human embryonic stem cells (hESCs) possess unique properties in terms of self-renewal and differentiation, which make them particularly well-suited for use in tissue engineering and regenerative medicine. The differentiation of hESCs in the form of human embryoid bodies (hEBs) recapitulates early embryonic development, and hEBs may provide useful insight into the embryological development of humans.

Herein, cell-penetrating magnetic nanoparticles (MNPs) were utilized to form hEBs with defined sizes and the differentiation patterns were analyzed. The MNPs were sufficiently delivered into hESCs, when feeder-free culture system of the hESCs was applied. Then the suspended and magnetized hESCs efficiently clustered into hEBs driven by magnetic pin-based concentrated magnetic force system. The size of hEBs was controlled by varying the suspended cell numbers which were added in a well of the concentrated magnetic force system. After 3 days of differentiation in a suspended condition, ectodermal differentiation was enhanced in small hEBs (150 μm in diameter) while endodermal and mesodermal differentiation was enhanced in large hEBs (600 μm in diameter).

In the spontaneous differentiation of size-controlled hEBs, some of small-sized hEBs, which showed glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positive staining, sprouted neurite-like outgrowth. In fact, many researchers have tried to induce neural differentiation of the hEBs due to the similarity of tissue elasticity to the brains and the correspondence of the enhanced intercellular interactions with the actual nerve cells. In this work, to improve the neural development of small-sized hEBs, neural induction medium (NIM) was applied for 5 days (Ⅳ) and they were compared with 3 other groups of hESCs

the undifferentiated hESCs which maintained their pluripotency (Ⅰ), the hESCs neurally induced in NIM for 5 days (Ⅱ) and the hESCs neurally induced in NIM with the MNPs for 5 days (Ⅲ). Neurally induced small hEBs showed significantly improved neural induction compared to the other groups. Furthermore, the MNPs themselves demonstrated neurogenic effect synergic with NIM. Additionally, signaling pathways of the accelerated neural induction of Ⅳ were detected through expression of representative proteins

WNT proteins, dopaminergic neuronal proteins, proteins related to intercellular communications, and proteins related mechanotransduction.

To summarize, MNP-based size-controlled hEB generation method was devised and using this technique, it was revealed that the size of hEBs is one of the important factors that determine the direction of early differentiation of hESCs. In addition, small-sized hEBs, generated via the MNP-based methodology, were neurally induced and the neural induction was effectively improved, reducing the time required for early neural induction. Furthermore, it was confirmed that this process followed the WNT3 signaling pathways and dopaminergic neuronal pathways. Additionally, it was revealed that this result was caused by the enhancement of the intercellular interactions and mechanotransduction, resulting from the hEB generation technique using MNPs. Therefore, the MNP-based hEB size control method proposed in this study would be useful for inducing lineage-specific differentiation of hESCs and determining the cell fate. If this technology could be used to induce the differentiation of hESCs into a variety of cell types, applications to tissue engineering and simulations of embryogenesis would be possible.