Effect of Internalized Prebiotic Nanoparticles on the Anti-Pathogenic Activity of Probiotic Pediococcus acidilactici

Abstract

항생제는 의약, 식품 보존제, 축산 등 다양한 분야에서 이용이 되어져 왔다. 하지만, 항생제의 오남용으로 항생제 저항성 미생물의 수가 높은 수준까지 증가하였고 이로 인한 병원균 감염이 사회적으로 위협이 되고 있다. 이에, 축산분야에서는 성장촉진용 사료첨가용 항생제의 사용을 금지하였고 이를 대체 할 수 있는 항생제 대체제를 개발하고자 노력하고 있다. 항생제 대체제 중 하나로 생균제의 사용이 증가되고 있고 이에 관한 연구가 많이 이뤄지고 있다. 생균제는 살아있는 미생물로서 적정량을 급여하거나 섭취하였을 때 항균 능력과 장내미생물 균총을 변화시킴에 따라 건강증진 효과를 보인다고 알려져 있다. 다양한 생균제 중에서도 Pediococcus acidilactici (PA)는 다양한 환경에서 성장 할 수 있고, 다양한 형태의 항균 물질(유산, 박테리오신)을 분비함에 따라 여러 병원균(Escherichia coli, Salmonella, Listeria)에 대한 억제 효과를 지니고 있어서 식품이나 축산업계에서 많이 이용되고 있다. 하지만, 아직까지는 생균제 단독이 분비하는 항균물질의 양이 적어 항생제를 대체하기에는 어려움이 있다.

프리바이오틱스는 장내 미생물이나 생균제의 성장 및 기능을 증진시킬 수 있는 물질로서, 생균제와 함께 이용하여 생균제의 효능을 증진시키고자 많이 이용되고 있다. 더불어, 나노입자의 사용이 증진되고 있는데, 이는 나노입자가 다양한 물리적 생리적 장벽을 극복할 수 있는 특징을 지니고 있을 뿐 아니라, 몇몇 나노입자들의 경우 직접적으로 병원균에 효과가 있다는 것이 밝혀지고 있기 때문이다. 이에 본 연구에서는 프리바이오틱스를 프리바이오틱스 나노입자 형태로 바꾸어 사용함으로써, 생균제의 기능을 더욱 증진시켜 항생제 대체제로서의 기능을 높이고자 하였다. 두 가지 다당류인 이눌린과 덱스트란을 이용하여 두가지 종류의 프리바이오틱스 나노입자를 개발하였다. 프리바이오틱스 나노입자는 다당류인 이눌린과 덱스트란에 소수성 잔기들인 프탈기(phthalic anhydride), 아세틸기 (acetic anhydride), 프로필기 (propionic anhydride)를 결합하여 형성하였다. 이렇게 형성된 다양한 프리바이오틱스 나노입자들이 PA에 미치는 영향을 in vitro와 in vivo에서 확인하였다.

Study 1에서는 세가지 종류의 이눌린 나노입자를 합성하여 이들이 PA에 미치는 영향을 분석하였다. 이눌린 나노입자는 프탈기- (PINs), 아세틸기- (AINs), 그리고 프로피올기- (PrINs)를 도입하여 형성하였다. 합성한 나노입자들을 PA에 처리한 뒤, 항균능력의 변화를 측정하였을 때 나노입자를 처리한 모든 그룹에서 항균능력이 유의적으로 높아지는 것을 확인하였다. 특히, 세가지 나노입자 중에서 프탈기를 도입한 PINs이 병원균에 대해 항균능력을 가장 높이는 것으로 확인되었다. 이에 PINs이 PA의 항균능력을 증진시키는 원인을 분석하고자 하였다. 먼저, 나노입자들은 세포 내로 도입 (internalization)이 일어난다고 알려져 있기 때문에, PINs이 PA내부로 도입되는지 여부를 파악하였다. PINs은 나노입자의 크기가 작을 수록, 온도에 따라 도입이 되는 것을 확인하였다. 더불어, 나노입자의 도입이 transporter에 따라 달라지는지를 분석하기 위해 세가지 단당을 이용하여 분석을 진행하였을 때, 포도당 transporter를 인지함으로서 도입이 된다는 것을 확인 할 수 있었다. 나노입자의 도입으로 PA의 항균 물질 분비에는 어떠한 영향을 미쳤는지 보았을 때, PA의 항균펩타이드인 pediocin의 발현량이 유전적 그리고 단백질 수준에서 모두 증가하는 것을 증명할 수 있었다. 더불어, transcriptional한 분석을 통해 나노입자의 도입이 pediocin의 발현량을 증가시키는 메커니즘을 분석하고자 하였다. 그 결과, 나노입자가 도입된 그룹에서는 PA단독에 비해 스트레스 관련 유전자들의 발현량이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었고, 이는 나노입자의 도입이 PA에 약한 스트트레스를 유발한다는 사실을 파악할 수 있었다. 즉, 나노입자의 도입이 PA의 방어기작을 발동시킴으로써 pediocin의 발현량이 증가하고, 그 결과 그람 음성균 (살모넬라, 대장균)과 그람 양성균 (리스테리아균) 모두에서 PA단독 혹은 PA에 이눌린을 처리한 그룹에 비해 항균능력이 유의적으로 높아진다는 알 수 있었다.

Study 2에서는 프리바이오틱스의 종류가 변하여도 동일한 효과를 보일 수 있는지를 분석하기 위해, 덱스트란을 이용하여 나노입자를 형성하였다. 덱스트란 나노입자 (PDNs)를 PA에 처리하였을 때 PA의 항균능력이 PINs와 마찬가지로 유의적으로 높아지는 것을 확인하였다. 앞서 study 1에서 합성한 PINs와 동일한 메커니즘을 통해 PDNs의 항균능력이 증진되는지를 보기 위해 PDNs를 이용하여 추후 실험을 진행하였다. PA에 PDNs가 시간, 온도, 그리고 포도당 transporter를 인지하여 도입되는 것을 확인하였으며, 나노입자의 도입이 PA의 항균펩타이드인 pediocin의 발현량 증진에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 즉, PDNs의 도입은 PINs와 마찬가지로 PA의 방어기작을 증진시킴으로써 pediocin의 발현 수준을 유전적, 단백질 수준에서 높임으로써 그람 음성균과 그람 양성 병원균에 대해 PA의 항균능력을 높일 수 있는 것을 확인 할 수 있었다. 더 나아가서, study 2에서는 PDNs가 in vivo에서도 동일하게 항균 효과를 보이는지를 확인해보기 위해 동물 모델로 쥐를 활용하여 실험을 진행하였다. 다양한 병원균 중에서 EHEC O157:H7을 모델 병원균으로 사용하여 동물실험을 진행하였을 때, PDNs을 도입한 PA가 병원균의 감염을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인하였다. 병원균의 수는 줄이고, 프리바이오틱스와 관련된 유익균을 증진시킴으로써 병원균의 감염을 억제할 수 있음을 확인하였다. 더불어, PDNs를 도입한 PA를 처리한 그룹이 다른 그룹과는 다르게 장내미생물의 균총이 변화됨을 확인할 수 있었다.

Study 1과 2의 결과들을 통해 프리바이오틱스 나노입자의 도입이 생균제의 항균물질을 많이 분비할 수 있도록 하는 새로운 종류의 세포 자극 물질이며 이는 생균제의 대사를 변화시킴으로써 항생제 대체제로서 이용될 수 있을 뿐만 아니라 다양한 장내 질환을 치료하는 데에도 이용이 가능할 수 있다는 가능성을 제시하였다. 즉, 프리바이오틱스 나노입자를 이용하여 생균제의 항균능력을 증진시키는 것은 효과적인 가축 생균제의 개발 뿐 만 아니라 나아가서는 축산의 생산성 증진에도 기여할 것이다.

Antibiotics have been used in many fields, such as medicine, food preservation, and the livestock industry. However, the increasing number of antibiotic resistant strains of bacteria has increased bacterial infections and threatens modern society. The World Health Organization (WHO) recently revealed that antibiotic resistant bacteria have reached alarming levels in many nations of the world. Therefore, in the livestock industry, using antibiotics in animal feed has been prohibited. Thus, developing alternatives to antibiotics has become important in the livestock industry. Probiotics as alternatives to antibiotics are an emerging field. Probiotics can confer health benefits to the host when the appropriate amounts are administered because they have their own antimicrobial properties and can manage the gut microorganisms. Among the many probiotics, Pediococcus acidilactici (PA) has been widely used in the animal and food industry. PA is known to have antimicrobial activity against many pathogens such as Escherichia coli, Salmonella, and Listeria because it produces antimicrobial molecules (lactic acid and bacteriocin) and modulates the gut system. However, there are still some limitations on using probiotics as alternatives to antibiotics due to their low production of antimicrobial substances.

Given that prebiotics stimulate the growth and/or activity of probiotics located in the digestive tract and confer favorable health effects on the host, many strategies have been selected to use prebiotics to raise the growth or activity of probiotics. Sometimes, inorganic nanoparticles have been used because they have antimicrobial activity. In this study, prebiotics were chemically modified with hydrophobic groups to form prebiotic nanoparticles. To improve livestock productivity, as a replacement for antibiotics, prebiotic nanoparticles were used to enhance the antimicrobial ability of probiotics. Two types of polysaccharides, inulin and dextran, were used to develop the prebiotic nanoparticles. The prebiotic nanoparticles were prepared by conjugating hydrophobic groups such as phthalic anhydride, acetic anhydride, or propionic anhydride with polysaccharides. The effect of the different types of prebiotic nanoparticles on the cellular and antimicrobial activities of PA were investigated by in vitro and in vivo experiments.

In study 1, three types of inulin nanoparticles were developed. Phthalyl- (PINs), acethyl- (AINs) and propyl-inulin nanoparticles (PrINs) were developed as prebiotics, and their effects were observed on the cellular and antimicrobial activities of PA. The antimicrobial activities against pathogens were tested after the treatment with those nanoparticles for PA. All three types of inulin nanoparticles increased the antimicrobial property of PA. Among the three types of inulin nanoparticles, phthalyl inulin nanoparticles (PINs) showed the highest antimicrobial activity against pathogens. Therefore, a mechanism study was done to examine how the PINs could increase the antimicrobial property of PA. The internalization of the PINs into PA was first assessed. The internalization of the PINs was largely regulated by glucose transporters in PA, and the process was energy- and size-dependent. After the internalization of the PINs, a substantial amount of antimicrobial peptide (pediocin) was produced by PA. Therefore, the higher amounts of pediocin could be more effective against both Gram-positive (Salmonella Gallinarum and ETEC K88) and Gram-negative (L. monocytogenes) pathogens than PA alone or PA treated with inulin. When treated with the smallest PINs, PA exhibited a nine-fold increase in antimicrobial activity. The rise in pediocin activity in PA treated with PINs was accompanied by the enhanced expression of stress response genes (groEL, groES, and dnaK) and pediocin biosynthesis genes (pedA and pedD). Overall, the results suggest that the internalization of the PINs by PA causes mild stress in PA activating the defense mechanism which leads to an increase of pediocin production.

In study 2, to demonstrate the previous concept with different types of prebiotic nanoparticles, phthalyl dextran nanoparticles (PDNs) were developed as prebiotics. Initially, the antimicrobial property of PA significantly increased after the treatment with PDNs. Moreover, there was no difference between the PINs and PDNs for enhancing the antimicrobial activity of PA. Therefore, to identify if the mechanism for increasing the antimicrobial property of PA with PDNs was same as the PINs, another experiment was conducted with the PDNs. The internalization of the PDNs by probiotics was dependent on temperature, time, and the glucose transporter. Internalization of the PDNs enhanced the production of an antimicrobial peptide which resulted in the higher antimicrobial properties of the probiotics against Gram-positive and Gram-negative pathogens compared to those of probiotics without any prebiotics. Moreover, internalization of the PDNs increased the gene expression of pediocin through a probiotic self-defense mechanism. These results were consistent with the previous results for the PIN nanoparticles. Moreover, in study 2, an animal experiment was done to see if the higher pediocin production may also suppress pathogenic gut infection. One pathogen, EHEC O157:H7, was chosen to test the antimicrobial effect of PA with internalized PDNs in animals. Probiotics internalized with PDN was able to suppress pathogenic gut infections by decreasing pathogens and increasing some other bacteria species that are related with the prebiotics. Moreover, the population of the gut microbiome in the probiotics internalized with the PDN group was altered toward the other groups, especially when compared with the pathogen only treated group.

Results from study 1 and 2 indicate that prebiotic nanoparticles can be an intracellular stimulator regulating probiotic bacterial metabolism and suggest a new avenue for the probiotic modulation of antimicrobial peptides and their use in the potential treatment of many gut diseases. Therefore, as a replacement for antibiotics, enhancing antimicrobial ability using prebiotic nanoparticles will eventually improve livestock productivity.