Bioprocess optimization of xylobiose synthesis using β-xylosidase from Bacillus pumilus

Abstract

A desirable sugar complement is a functional sweetener that plays a role in inhibiting sucrase in the small intestine when taken along with sucrose. Xylobiose, a disaccharide with two xylose molecules, is a major component of xylooligosaccharides and is known as the best prebiotic supplement, which can selectively stimulate the growth of Bifidobacterium species. Recently, xylobiose has attracted attention as a bifunctional sweetener that can be used as a sugar complement having sucrase inhibition potency as well as a prebiotic ingredient. However, to produce high-purity xylobiose, the purification process involves the hydrolysis product of xylan which is extracted from the biomass (such as straw and corn cob)

however, the production process is complicated and the cost is too high for a food ingredient. In this study, we have established an environment friendly and simple production process that can produce xylobiose from low-cost xylose by exploiting the condensation reaction of beta-xylosidase and have identified the characteristics of such a synthetic xylobiose. For enzymatic xylobiose synthesis, selection of beta-xylosidase having high xylobiose formation efficiency, optimization of synthesis conditions, and characterization of synthesized xylobiose were performed.

Among twelve beta-xylosidases, beta-xylosidase from Bacillus pumilus IPO, which has the highest efficiency of xylobiose synthesis, was selected and an enzyme expression system was constructed in Saccharomyces cerevisiae for its use in the food industry. To increase the productivity of beta-xylosidase, C/N ratio, N-source type, and glucose feeding speed of the medium were considered in a fed-batch fermentation strategy. Through fed-batch fermentation, beta-xylosidase production was increased to 717.3 U/L (productivity 18.3 U/gDCW), which was 7.1 times higher than the production by batch culture methods. Over 70% plasmid stability of the beta-xylosidase-expressing strain was maintained during fermentation. Optimization conditions for xylobiose synthesis were derived from the central composite design of response surface methodology. Xylobiose was produced at a maximum of 214.0 g/L using 6.7 M of xylose with 6.5 U/mL of beta-xylosidase at 50℃ for 24 hr, which was the highest quantity of xylobiose synthesized among production procedures employing beta-xylosidase and 9.4 times higher than the quantity reported in previous studies that employed fungal beta-xylosidase. Additionally, synthetic reaction could occur without additives such as buffer solutions or high sorbitol concentration, and no additional steps were required to remove the additive. The synthesized xylobiose was a mixture of beta-1,4- (51.5%) > beta-1,3- (35.9%) > beta-1,2-linkage (12.6%). The synthetic xylo-disaccharides were characterized by excellent acid resistance and thermal stability, which remained at least 90% even after 90 min of exposure at 100℃ under strongly acidic condition (pH 2). They also had a potency to inhibit intestinal rat sucrase similar to beta-1,4-xylobiose (p < 0.05).

Therefore, xylobiose, synthesized using beta-xylosidase from B. pumilus IPO, could be used as a sugar complement for inhibiting the activity of sucrase as well as for providing a basis for industrial production by simplifying the process and increasing productivity. Furthermore, because synthetic xylobiose has excellent properties of acid resistance and thermal stability, it can be used as a multi-functional sweetener.

바람직한 설탕보완재 (Sugar complement)는 설탕과 함께 섭취할 경우 설탕의 감미특성은 유지시키고, 체내 설탕분해효소의 활성을 억제하는 기능이 있는 감미료이다. 자일로바이오스 (Xylobiose)는 자일로오스 두 분자가 결합된 이당류로 자일로올리고당의 주요 성분이자 비피도박테리움 속에 의해서 선택적으로 이용되는 가장 좋은 프리바이오틱스로 알려졌다. 최근 자일로바이오스는 설탕분해효소를 저해하는 기능이 밝혀지면서 설탕보완재와 프리바이오틱스로 활용될 수 있는 양기능성 감미료로 주목 받게 되었다. 하지만 고순도 자일로바이오스를 생산하려면 목질계에서 분리한 자일란의 가수분해 산물로부터 분리공정을 거쳐야 하기 때문에 생산공정이 복잡하고 비용이 높은 한계가 있어 아직까지 식품소재로 활용되지 못하고 있다. 본 연구는 베타자일로시데이즈 (Beta-xylosidase)의 축합반응 (Condensation reaction)을 이용해서 가격이 저렴한 자일로오스에서 자일로바이오스를 생산할 수 있는 친환경적이고 단순한 생산공정을 확립하고, 합성된 자일로바이오스의 특성을 규명해서 식품소재로 활용할 수 있는 기반을 마련했다.

열두 종의 베타자일로시데이즈 중에서 자일로바이오스 합성효율이 가장 우수한 Bacillus pumilus IPO 유래의 베타자일로시데이즈를 선별했고, 식품산업에 사용할 수 있는 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에 효소 발현시스템을 구축했다. 효소의 생산성을 높이기 위한 유가배양 (Fed-batch culture) 전략으로 배지의 탄소원/질소원 비율, 질소원 종류, 포도당 공급속도를 고려했다. 유가배양을 통해서 베타자일로시데이즈의 생산량은 회분배양 (Batch culture) 보다 7.1 배 높은 717.3 U/L (생산성 18.3 U/gDCW)까지 증가시켰다. 효소생산 균주의 플라스미드 안정성은 70% 이상으로 유지되었다. 자일로바이오스의 합성을 위한 최적화 조건은 반응표면설계 (Response surface methodology, RSM)의 중심합성계획법 (Central composite design, CCD)을 통해서 도출했다. 6.7 M 자일로오스, 6.5 U/mL 베타자일로시데이즈, 50℃ 반응 조건에서 최대 214.0 g/L의 자일로바이오스가 생산되었다. 이것은 지금까지 보고된 생산량 중에서 가장 높았고, 곰팡이 유래 베타자일로시데이즈를 이용한 선행연구보다 9.4 배 높았다. 게다가 반응물은 완충용액 및 솔비톨과 같은 첨가물을 사용하지 않았기 때문에 염분이나 첨가제를 제거하는 공정을 생략할 수 있는 장점이 있다. 합성된 자일로바이오스는 베타-1,4 결합 (51.5%) > 베타-1,3 결합 (35.9%) > 베타-1,2 결합 (12.6%) 로 구성된 자일로-이당류 (Xylo-disaccharides)로 밝혀졌다. 자일로-이당류는 pH 2의 산성 조건아래 100℃에서 90 분 동안 노출시켰을 때 최소 90% 이상 유지될 만큼 내산성과 열 안정성이 매우 우수한 특징이 있었다. 또한, 이들은 쥐 소장에서 추출된 설탕분해효소에 대한 활성 저해기능이 베타-1,4 자일로바이오스와 유사한 것으로 나타났다 (p < 0.05).

따라서 베타자일로시데이즈를 이용한 자일로바이오스 합성공정 개발은 반응조건의 최적화로 인한 생산성 증대 및 친환경적 공정의 단순화를 통해서 산업적으로 생산할 수 있는 기반을 마련했다. 또한, 자일로-이당류는 설탕분해효소의 활성을 저해하는 설탕보완재로 사용이 가능할 뿐만 아니라 내산성과 열 안정성이 우수하기 때문에 다양한 기능성 감미료로 활용이 가능할 것이다.