Potential Biomarker of Autoantibody to Extracellular Protein Kinase A in Dogs with Cancer

Abstract

암은 개의 사망률 1위 질환이며, 진단 기술의 발달로 인해 개의 암 유병율은 점점 높아지고 있다. 암환자에서 생존기간을 늘리고 삶의 질을 증가시키기 위해서 암을 조기에 진단하여 적절한 치료가 수행되어야 한다. 암 바이오마커는 암을 조기에 확인할 수 있는 하나의 방법으로써, 암 바이오마커의 안전성, 편리성, 임상에서 적용 가능한 다양한 잠재적 가능성 때문에 암 바이오마커에 대한 관심이 높아지고 있다. 임상에서 암 바이오마커는 환자가 암에 걸릴 수 있는 잠재적 위험이나 암의 이환 가능성을 평가할 수 있으며, 암의 진단, 진행, 치료 상태를 관찰하는 데 이용될 수 있다. 또한, 특정 약물에의 치료 반응을 예측할 수 있으며, 암의 예후에 대한 정보를 알려줄 수 있다. 사람에서는 이미 다양한 암 바이오마커가 연구되었고, 그 중 몇 가지는 임상에서 사용이 되고 있다. 세포외단백질인산화효소 A의 자가항체는 인의에서 보편적 악성종양 바이오마커로 사용될 수 있음이 증명되었지만, 수의학에서는 악성종양을 가진 개 환자에서의 세포외단백질인산화효소 A 자가항체에 대한 연구가 전무한 실정이다. 따라서, 혈청에 존재하는 세포외단백질인산화효소 A 자가항체가 개에서도 악성종양의 바이오마커로 이용될 수 있을 것이라는 가설을 세우고 연속적인 연구를 진행하게 되었다.

먼저, 악성종양을 가진 개에서 세포외단백질인산화효소 A 자가항체와 급성 염증 단백질인 C 반응성 단백질이 혈청 중에서 높게 존재하는지의 여부를 확인하는 연구를 진행하였다. 서울대학교 수의과대학 부속동물병원과 국내 지역병원에 내원한 총 487 마리의 개의 혈청을 실험에 이용하였다. 총 487 마리의 개는 123마리의 건강한 개와 155마리의 비종양성 질환의 개, 42마리의 양성 종양을 가진 개, 167마리의 악성 종양을 가진 개로 구성되었다. 혈청에서의 세포외단백질인산화효소 A 자가항체와 C 반응성 단백질의 양은 ELISA 방법을 이용해 검출하였다. 세포외단백질인산화효소 A 자가항체와 C 반응성 단백질을 각각 변수로 한 다중회귀분석을 통해 새로운 지표인 Neoplastic index (NI)를 만들었다. 악성종양을 가진 개에서는 악성종양이 없는 개에 비해 세포외단백질인산화효소 A 자가항체와 NI가 모두 유의적으로 높게 확인되었다. 인자의 악성종양 구별 능력 정도를 확인하는 수신자 조작 특성 (receiver operating characteristic)은 세포외단백질인산화효소 A 자가항체와 NI에서 곡선아래면적이 각각 0.86, 0.89로 높게 나타났다. NI 지수는 세포외단백질인산화효소 A 자가항체에 비해 암을 진단하는 데 있어 민감도, 특이도, 정확도가 약간씩 높은 것으로 확인되었다. 결론적으로 세포외단백질인산화효소 A 자가항체와 NI 지수는 모두 개에서 보편적 악성종양 바이오마커로 이용될 수 있을 것으로 판단되었다.

다음으로, 세포외단백질인산화효소 A와 세포외단백질인산화효소 A 자가항체가 종양의 크기에 의존적인지의 여부를 확인하기 위해 Lewis lung carcinoma (LLC1) 세포주를 이용하여 생체 외 (in vitro) 검사와 생체 내 (in vivo) 검사를 진행하였다. 생체 외 검사에서는 LLC1 세포의 양을 다르게 배양하였을 때 세포 내에서 단백질인산화효소 A의 유출과 관계 있는 PRKARⅠA, PRKARⅡB, PRKACA 세 개의 유전자 발현 정도의 차이를 확인하기 위하여 qRT-PCR 검사를 진행하였으며, 세포 내 단백질인산화효소 A의 양은 western blot 검사법을 통해 확인하였다. 세포 외 단백질인산화효소 A의 양은 배양 배지를 이용해 ELISA를 진행하여 분석하였다. 생체 내 연구는 C57BL/6J 마우스를 이용하여 진행하였으며, 종양의 크기에 따른 단백질인산화효소 A와 자가항체의 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다. C57BL/6J 마우스는 총 다섯 개의 그룹 (대조군, 종양 100 mm3, 종양 300 mm3, 종양 600 mm3, 종양 1000 mm3)으로 구분되었다. 그 결과, 세포외단백질인산화효소 A는 혈청 중에서 검출할 수 없는 정도로 미량 존재하는 것이 확인된 반면, 세포외단백질인산화효소 A 자가항체는 혈청 중에서 매우 높은 농도로 존재하며, 종양의 크기가 증가할수록 혈청 내 농도가 증가하는 것이 확인되었다. 이를 통해 세포외단백질인산화효소 A 자가항체가 세포외단백질인산화효소 A 자체보다 검출이 용이하며, 종양의 크기에 비례하여 증가한다는 것을 확인하였다.

마지막으로, 자연적으로 발생한 림프종과 방광이행상피암종의 개에서 질병이 진행에 따라 혈청 중 세포외단백질인산화효소 A 자가항체의 양이 어떻게 변화하는지 분석하였다. 개에서 가장 유병율이 높은 악성종양으로 혈액암과 고형암의 대표적 종양인 림프종과 방광이행상피암종을 각각 선정하였다. 혈청 샘플은 치료 여부와 시기에 따라서 치료 전, 치료 후, 재발로 구분하였으며, 치료 후 샘플은 치료 반응에 따라 병의 완전한 차도, 부분적인 차도, 변화 없음, 진행성 질병으로 구분하였다. 혈청 중 세포외단백질인산화효소 A 자가항체의 양은 치료 여부와 시기에 따라 다르게 나타났으며, 일반적인 개 림프종 치료요법인 CHOP protocol로 치료를 하였을 때, 치료 전 샘플에서의 세포외단백질인산화효소 A 자가항체의 농도가 치료 반응이 좋은 개체는 치료에 반응이 없는 개체에 비해 유의적으로 낮은 것이 확인되었다. 방광이행상피암종을 앓고 있는 개들은 모두 piroxicam을 적용 중이었으나 질병이 악화되었고, 질병이 악화됨에 따라 혈청 내 세포외단백질인산화효소 A 자가항체의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 혈청 세포외단백질인산화효소 A 자가항체의 양은 림프종과 방광이행상피암종을 앓고 있는 개에서 치료반응을 예측하는 바이오마커가 될 수 있을 것으로 추정한다.

종합해 보았을 때, 혈청 중에 존재하는 세포외단백질인산화효소 A 자가항체는 개에서 보편적 악성종양 바이오마커가 될 수 있을 것으로 생각되며, 암의 존재에 대한 정보뿐만 아니라 일부 종양에서의 특정 항암제에 대한 치료 반응 예측, 고형암의 진행 상황 관찰에 대한 정보까지 제공해주는 바이오마커로 기능할 수 있을 것으로 생각된다.

Cancer is the leading cause of mortality in adult dogs. Early detection of cancer is needed to prolong the survival rate and quality of life of cancer patients. Cancer biomarker are tools for the early detection of cancer

interest in cancer biomarkers has been increasing due to their safety, convenience, and potential to screen, diagnose, monitor, assess the risk, and predict the prognosis of cancer patients. In human medicine, various cancer biomarkers have been introduced and used in clinical settings. The extracellular protein kinase A autoantibody (ECPKA-Ab) has been demonstrated as a universal cancer biomarker in humans. However, there have been no studies about ECPKA-Ab in dogs with cancer. Therefore, Serial researches were conducted to evaluate the potency of serum ECPKA-Ab as a cancer biomarker in dogs.

This dissertation comprises three parts. The first part of this study investigated whether high levels of serum ECPKA-Ab and C-reactive protein (CRP) were present in dogs with cancer. Total 487 serum samples were collected from client-owned dogs from the Seoul National University Veterinary Medicine Teaching Hospital and several local animal clinics

sera were collected from 123 healthy dogs, 155 non-neoplastic disease-affected dogs, 42 benign tumor-affected dogs, and 167 malignant tumor-affected dogs. The ECPKA-Ab and CRP levels in the serum samples were analyzed by ELISA method. The neoplastic index (NI) was derived from multivariate regression analysis with ECPKA-Ab and CRP as the independent variables. As a result, both ECPKA-Ab and NI levels were shown to be significantly higher in dogs with malignant tumors than in those without malignant tumors. The area under the receiver operating characteristic was 0.86 and 0.89 for ECPKA-Ab levels and NI value, respectively. The NI value had slightly higher sensitivity, specificity, and accuracy in diagnosing cancer than ECPKA-Ab levels. In conclusion, both ECPKA-Ab and NI value could be used as a universal cancer biomarker in dogs.

The second part of the dissertation tested the dependence of both serum ECPKA and ECPKA-Ab levels on the tumor size. Using the Lewis lung carcinoma (LCC1) cell line, an in vitro study was performed, in which the mRNA levels of PRKAR1B, PRKAR2B and PRKACA according to the seeding cell number were analyzed via qPCR, and the cytosolic/extracellular PKA levels according to the seeding cell number were analyzed via ELISA and Western blotting. An in vivo study with C57BL/6J mice was performed to analyze the serum ECPKA and ECPKA-Ab levels according to the tumor size, based on which the mice were divided into five groups (control, tumor100 mm3, tumor300 mm3, tumor600 mm3, and tumor1000 mm3). Increased cell number induced increased extracellular protein kinase A level in conditioned medium, and increased protein kinase A level in cell, but not affect the mRNA levels. In mouse study, it was demonstrated that the serum ECPKA-Ab levels increased with the increase in tumor size whereas most of mice had undetectable ECPKA levels in their serum. Serum ECPKA-Ab levels increased in proportion to tumor size, and were found to be a more sensitive factor than the antigen.

The third part of the dissertation shows the serial monitoring of serum ECPKA-Ab levels of dogs with naturally occurring lymphoma and transitional cell carcinoma (TCC). The samples were categorized with regards to treatment status as pre-treatment, post-treatment, and relapse

the post-treatment samples were further subcategorized into complete remission and progressive disease, according to the therapeutic response. The serum ECPKA-Ab levels were analyzed via ELISA assay. As a result, the serum ECPKA-Ab levels differed significantly with treatment statuses, and the pre-treatment levels differed in response to the CHOP protocol. There was no statistically significant difference in ECPKA-Ab levels when the sera were classified according to location, stage, substage and immunophenotype. All TCC-affected dogs treated with piroxicam had progressive disease and their serum ECPKA-Ab levels increased with the progression of the cancer. The serum ECPKA-Ab levels could be a predictive cancer biomarker for lymphoma and TCC in dogs.

In conclusion, the serum ECPKA-Ab levels could be a universal cancer biomarker in dogs

it could provide several details about the presence of various cancer, the prediction of therapeutic response to specific chemotherapeutic drugs to certain cancer, and monitoring the progression status of some cancers.