Prevalence, Transmission, and Molecular Mechanisms of Antimicrobial Resistance of Escherichia coli from Food-producing Animals in Korea

Abstract

국문초록

국내산업동물유래 Escherichia coli 항생제 내성의 분포, 전달성 및 분자유전학적 특성

KUASTROS MEKONNEN BELAYNEHE

(지도교수: 유한상, D.V.M., Ph.D.)

서울대학교 대학원

수의학과 수의병인생물학 및 예방수의학 전공

항생제 내성 문제는 공중보건학적으로 21 세기에 가장 중요한 이슈 중 하나이며, 항생제 내성 발달은 미생물의 자연 진화 산물이기도 하지만, 항생제 소비와 항생제 내성균 발달 사이에 연관성이 있을 것이라는 연구 결과들이 계속적으로 의학과 수의학 연구분야에서 확인되고 있다. 일반적으로 축산물로 소비되는 산업 동물이 사람과 동물간에 항생제 내성을 전파를 하는 중요 매개체 역할을 할 것이라 여겨지고 있으며, 다양한 항생제 계열의 내성 패턴들이 병원성 / 공생성 대장균에서도 일반적으로 관찰되고 있다. 이번 연구를 통하여, 국내산업동물에서 분리한 대장균 분리 주들의 항생제 내성 패턴들을 확인하였다.

첫 번째로 국내 소 농장에서 247주의 대장균을 분리하여, aminoglycoside-modifying enzyme (AME) 유전자를 조사하였으며, 그들의 플라스미드 복제물 (plasmid replicons)과 전달성여부를 조사하였다. 이번 연구에서는 다양한 항생제 계열에서 높은 항생제 내성률이 관찰되었고, 특히 streptomycin 내성이 56.3% (139개 분리주)로 가장 많이 관찰되었으나, 주로 비 병원성 균주 (B1, A)에서 확인되었다. 주요 aminoglycoside 내성인자로는 aph3-1a, aph3-1b 이 확인 되었고, 표현형에서 내성이 확인되었지만, AME 유전자는 확인되지 않았다. Broth 접종을 통한 conjugation 실험에서 내성 유전자 전달유무를 확인한 결과, 63.2%의 분리 주에서 AME 유전자가 전달됨을 확인하였고, aph3-1a 유전자는 IncFIB replicon-type의 주요 내성 유전자인 것으로 확인되었다. PFGE 을 통한 유전자 분석에서는 14개의 클러스터 유형이 확인되었으며, 이는 공생성 대장균들이 AME 유전자의 전파 역할을 하며, 잠재적으로 공중보건학적인 문제를 일으킬 수 있음을 제시하고 있다.

두 번째로, 대장균의 class 1 integron과 관련된 다양한 유전자 cassette와 항생제 내성 메커니즘을 확인하였는데, tetracycline 내성과 관련하여, 내성 표현형과 class1 integron 운반과의 연관성은 거의 알려진바 없으나, 이번 연구에서 분리된 92개의 모든 분리 주들이 최소 한 개 이상의 tetracycline 내성인자를 가지고 있었고, tet(A), tet(B) 유전자가 주요 내성 인자로 확인되었다. tet 유전자를 가지고 있는 비율이 class 1 integrons 유전자 (intI1)를 가지고 있는 비율에서 높았으며, 다른 표현형과 비교해봤을 때, intI1 gene 의 경우, B2 그룹에서 낮은 비율이 관찰되었다. 또한 38개의 분리 주 (41.3%)에서 intI1 gene을 가지고 있음을 확인하였고, 그 중 27개의 분리주의 3ʹ-CS 에서 sul1, qacE∆1이 확인되었다. Sulfonamide 내성 유전자의 경우 3′-CS의 class 1 integrons이 39.1%의 분리 주에서 확인되었고, 7개의 유전자 cassette가 단독으로 또는 다른 유전자 cassette 함께 확인되었는데, 이러한 내성 유전자들은 다양한 계열의 항생제에 대한 내성 스펙트럼을 형성하게 하며, class 1 integrons의 경우 공생성 대장균에 널리 전파되어 있으며, tetracycline 내성 결정인자 운반과 연관성이 있다. 반면에 병원성 그룹에서 분리한 분리 주에서는 intI1 유전자를 적게 가지고 있는 것으로 확인되었다.

마지막으로 임상적으로 건강한 동물의 분변 샘플에서 획득한, 636개의 공생성 대장균 분리 주에서 플라스미드 유래 콜리스틴 내성율과 유전학적 메커니즘, 내성 유전자의 전달성여부를 조사한 결과, 콜리스틴에 대한 저항성이 9개의 분리주 (1.4%)에서 확인되었으며, 그 중에서 mcr-3, mcr-1 내성 유전자가 2개, 3개의 분리 주에서 각각 확인되었다. mcr-1, mcr-3 유전자를 가진 모든 분리주들은 다양한 항생제 내성 유전자를 가지고 있음이 확인되었고, 이는 conjugation 분석을 통한 E. coli J53 AZR 균주로의 전달 유무로 확인하였다. mcr-3 유전자를 가지고 있는 또 다른 분리주인 17S-208를 Whole Genome Sequencing (WGS) 으로 플라스미드를 분석한 결과, plasmid p17S-208 (260,339bp)에서 241개의 predicted ORFs를 확인하였고, 다양한 항생제에 내성을 갖는 유전자들이 확인되었다. In silico plasmid finder tool에서는 p17S-208의 경우 전형적인 IncHI2-type backbone을 보여주고 있음을 확인하였고, plasmid MLST 분석결과 ST3에 속하는 것을 확인하였다. p17S-208 플라스미드를 다른 28개의 세균 종의 deduced amino acid 서열과 비교해본 결과, 벨기에의 돼지에서 분리된 p17S-208의 mcr-2, 한국의 환자에서 분리된 mcr-1 유전자와 35%의 동일성을 갖는 것을 확인하였는데, 반면에 중국에서 분리된 p17S-208의 mcr-3과는 100%의 동일성을 보인 것을 확인하였다. 콜리스틴을 치료목적으로 적용할 때는 반드시 주의가 필요하며, 정기적인 WGS기반 조사가 mcr 내성 유전자를 조기 발견하고, 새로운 mcr 내성 유전자를 확인하는데, 필수적이다.

결론적으로, 항균 내성 박테리아의 문제는 매우 복잡하고 광범위하다. 게다가 저항성유전자가 한 생물체에서 다른 생물체로 퍼질 가능성이 높다. 또한 산업동물에서 기인 한 저항 세균의 확산과 출현을 제한하기 위해 적절한 진단 기술을 사용하는 정기적 인 감시가 보장되어야 한다. 따라서 앞으로의 연구 방향은 다양한 저항 메커니즘의 특성화, 효과적인 신약 개발 및 통합 된 학제 간 접근을 통한 제어 전략에 초점을 맞추어야 할것으로 생각된다.

핵심어: 대장균, AME 유전자, 전달성, class 1 integrons, tetracycline내성, phylogenetic그룹, mcr 유전자들, IncHI2-ST3 형 플라스미드

학번: 2014-31494

Abstract

Prevalence, Transmission, and Molecular Mechanisms of Antimicrobial Resistance of Escherichia coli from Food-producing Animals in Korea

Kuastros Mekonnen Belaynehe

(Supervisor: Prof. Han Sang Yoo, D.V.M., Ph.D)

Department of Veterinary Medicine

The Graduate School

Seoul National University

Antimicrobial resistance is one of the top health challenges facing the 21st century. Although antimicrobial resistance is an inevitable consequence of the evolutionary adaptation of microbes, there is a clear connection between consumption of antimicrobial agents and the subsequent development of antimicrobial resistant organisms both in human and veterinary medicine. Generally, food-producing animals are regarded as an important reservoir and play an immense role in transmission of antimicrobial resistance between animals and humans. A rapid rise was observed both in the prevalence and newly emergence of antimicrobial resistance. This is particularly common in pathogenic and commensal Escherichia coli harboring antimicrobial resistance determinants for various classes of antimicrobials currently in use. Hence, the results presented in this study offer a contribution to understand the evolving mechanisms of antimicrobial resistance and the pattern of different classes of antimicrobials resistance in E. coli isolates obtained from food-producing animals in South Korea.

First, a total of 247 E. coli isolates collected from four cattle farms were investigated for aminoglycoside-modifying enzyme (AME) genes, their plasmid replicons and transferability. The isolates showed high prevalence of resistance to various antimicrobials. Streptomycin resistance was the most detected in the isolates 139 (56.3%) and the isolates were mainly categorized under the non-pathogenic phylogroups (B1 and A). The principal aminoglycoside resistance determinate observed were aph3-1a and aph3-1b. Some strains showed phenotypic resistance without carrying AME gene. Conjugation experiments showed the majority of the isolates (63.2%) were capable of transferring AME genes and aph3-1a was the dominant transferred gene via the IncFIB replicon-type. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis showing 14 distinct cluster types indicated higher degree of genetic diversity in the isolates. This suggests the role of commensal E. coli isolates in carrying and dissemination of transferable AME genes and posing a potential public health risk.

The second study was performed with the objective of characterizing class 1 integrons, their associated diverse gene cassettes and related antimicrobial resistance mechanisms were characterized in the isolates. Little is known about the relationship between class 1 integron carriage with respect to phylogroups and patterns of tetracycline resistance. Of the 92 isolates included in this study, all the isolates at least carried one of the tetracycline resistant determinants. tet(A) and tet(B) were identified as the predominant tet genes. The prevalence of tet gene carrying isolates were significantly higher in isolates harboring class 1 integrons gene (intI1). Compared to other phylogroups, a significant lower presence of intI1 gene was observed in B2 phylogroup. Out of 92 isolates, 38 (41.3%) isolates carried the intI1 gene and among them 27 isolates had sul1 and qacE∆1 at the 3ʹ-CS. Sulfonamide resistance gene (sul1) was also detected in 39.1% of isolates as a 3′-CS component of class 1 integrons. Seven gene cassettes were identified, either alone or in combination with another gene cassette. These genes, in the cassettes, encode versatile resistance spectrum that confer resistance to different classes of antimicrobials. Class 1 integrons have spread into a commensal E. coli strains and associated with carriage of tetracycline resistant determinants. While on the contrary, isolates in the pathogenic phylogroups carried intI1 gene to a lesser extent.

Lastly, a total of 636 commensal E. coli isolates recovered from fecal samples obtained from clinically healthy animals were used to investigate the prevalence, genetic mechanism, and transferability of plasmid-mediated colistin resistance. Non-susceptibility to colistin was detected in 9 (1.4%) isolates, and among those isolates the mcr-3 and mcr-1 genes were detected in 2 and 3 isolates, respectively. All isolates harboring mcr-1 and mcr-3 genes were multidrug resistant (MDR) and harboring various antimicrobial resistant genes that were confirmed to be transferred to a recipient E. coli J53 AZR strain via conjugation assay. E. coli isolate, 17S-208, harboring mcr-3 gene was selected for further plasmid analysis using whole genome sequencing (WGS). Plasmid p17S-208 (260,339bp) containes 241 predicted ORFs and encodes genes resistant to various antimicrobial agents. The in silico plasmid finder tool demonstrated that p17S-208 exhibited a typical IncHI2-type backbone. Plasmid MLST showed that p17S-208 belonged to sequence type ST3. Comparison of the p17S-208 plasmids with deduced amino acid sequence of 28 other bacterial species depicted that p17S-208 had 35% identity with mcr-2 isolated from a swine in Belgium and mcr-1 isolated from a patient in South Korea, whereas 100% identity with mcr-3 isolated from swine in China. Care when applying colistin for therapeutic purposes has to be encouraged and regular WGS-based surveillance is a requisite to early detection of mcr genes, and to describe novel mcr genes.

In conclusion the issue of antimicrobial resistant bacteria is extremely complex and widespread. Besides, there is a high possibility for those resistant bacteria can spread from one living thing to another. Moreover, a regular surveillance using appropriate diagnosis technique to limit the further spread and emergence of resistance bacteria originated from food-producing animals is warranted. Therefore, future research direction should focus on characterization of different resistance mechanisms, development of effective novel drugs and control strategy through coordinated interdisciplinary approach.

Keywords: Escherichia coli, AME genes, transferability, class 1 integrons, tetracycline resistance, phylogenetic group, mcr genes, IncHI2-ST3 type plasmid.

Student Number: 2014-31494