Glutamyl-Prolyl tRNA Synthetase Controls Collagen and Fibronectin Expression via STAT Signaling in Pulmonary and Hepatic Fibrogenesis

Abstract

섬유화란 염증성 및 대사성 질환에 의해 세포의 과분열과 장기의 기능부전이 일어나 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 이 비정상적으로 과다하게 축적되는 과정을 말한다. 최근 연구에 따르면 상산(常山, Dichroa febrifuga) 으로부터 분리된 화합물 febrifugine의 할로겐화 유도체인 halofuginone은 glutamyl-prolyly tRNA synthetase (EPRS)의 활성을 억제함으로써 섬유화를 저해한다고 밝혀졌다. 하지만 기존 연구에서는 halofuginone이 EPRS의 활성을 저해함에 있어서 EPRS의 번역적 활성에만 초점을 맞추었으며 in vivo 환경에서는 확인한 바 없으므로 EPRS를 타겟으로한 섬유화 치료제 개발을 위해서는 추가 연구가 필요한 상황이다. 본 연구에서는 폐 및 간의 섬유화 과정에서 ECM을 합성하는 EPRS의 비-번역적 기능을 연구하고 EPRS의 hetero knock-out 마우스를 이용하여 EPRS의 in vivo에서의 역할을 검증하고자 하였다.

우선 섬유화 과정 중 ECM 합성에 있어서 EPRS의 기능을 확인하고자 하였다. EPRS가 knock-down(KD) 되거나 overexpression 된 hepatic stellate cell (LX2 cell) 및 alveolar epithelial cell (A549 cell)에 TGFβ1을 처리하여 섬유화를 유도시킨 후 ECM의 발현을 살펴보았다. 그 결과 EPRS가 KD 된 세포에서는 Collagen I, Fibronectin, Laminin 과 같은 ECM의 발현이 감소했지만 PRS가 과발현된 세포에서는 ECM의 발현이 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 이는 western blotting을 통한 단백질 수준뿐만 아니라 qPCR 방식을 이용한 mRNA level 모두 비슷한 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, promoter luciferase assay를 통해 EPRS가 KD된 세포에서 collagen I 및 laminin γ2의 promoter가 down-regulation 되는 것을 확인할 수 있었으므로 EPRS는 ECM 발현의 전사적인 수준에서 수행함을 알 수 있었다.

다음으로 EPRS 가 매개된 ECM 의 합성 조절의 신호전달을 관찰하기 위하여 섬유화와 밀접한 관계가 있다고 알려진 STAT 분자들의 인산화 정도를 분석하였다. 그 결과 STAT6가 EPRS의 발현과 함께 EPRS가 과발현 되었을 때 인산화가 증가되고 EPRS가 KD 될 때 인산화가 저해 되는 것으로 관찰되었다. 또한 SMAD2 단백질이 과발현 될 경우 STAT이 activation되어 SMAD가 STAT의 상위 신호전달에 관여함을 알 수 있었다. Immunoprecipitation 방법을 이용한 실험 결과 TGFβ1 receptor, EPRS, Janus kinase 그리고 STAT6 사이에 단백질-단백질 결합이 이루어 짐으로써 신호전달이 이루어 짐을 확인할 수 있었다.

CCl4 처리 혹은 bile duct ligation 방법을 통해 간 섬유화를 유도하거나 bleomycin을 처리하여 폐 섬유화를 유도한 동물 실험 결과 fibrotic septa 주변에 STAT6의 인산화와 ECM의 발현이 동시에 증가 한 반면, 그 현상이 Eprs-/+ 마우스에서는 정도가 낮음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구 결과 섬유화 과정에서 EPRS는 TGFβ1의존적으로 세포신호전달에 의한 비-번역적 과정을 거처 ECM의 발현을 조절하는 것을 확인 할 수 있었다. EPRS 단백질은 향후 간 및 폐 섬유화 억제 치료제의 타겟으로 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.

Background: Fibrosis is characterized by the increased accumulation of extracellular matrix (ECM), which drives abnormal cell proliferation and progressive organ dysfunction in many inflammatory and metabolic diseases. Studies have shown that halofuginone, a racemic halogenated derivative of febrifugine, purified from Dichroa febrifuga, inhibits glutamyl-prolyl-tRNA-synthetase (EPRS)-mediated fibrosis. However, the mechanism by which this occurs was only focused on the translational function of EPRS and in vivo efficacies were not studied. Thus, in order to develop efficacious drugs targeting EPRS, more studies are needed. Methods: In this study, I explored the mechanistic aspects of how EPRS could develop hepatic and pulmonary fibrotic phenotypes in cells and animal models. CCl4 administration, bile duct ligation operation, and bleomycin administration were used in order to induce fibrosis in wild type (Eprs+/+) or Eprs-/+ C57B/L6 mice. Results: Treatment of transforming growth factor 1 (TGF1) up-regulated extracellular matrix proteins, including fibronectin and collagen I, in LX2 hepatic stellate cells and A549 alveolar epithelial cells. This effect was inhibited in EPRS-suppressed cells and enhanced in PRS-overexpressed cells. Using the promoter luciferase assay, TGF1-mediated COL1A1 (collagen I, 1 chain) and LAMC2 (laminin 2) transcription in LX2 and A549 cells were down-regulated by EPRS suppression, suggesting that EPRS may play roles in ECM production at transcriptional levels. Furthermore, signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling activation was involved in the effects of TGF1 on ECM expression in an EPRS-dependent manner. This was mediated via a protein-protein complex formation consisting of TGF1 receptor, EPRS, Janus kinases, and STATs. Additionally, ECM expression in fibrotic livers and lungs were overlapped with EPRS expression along fibrotic septa regions and was positively correlated with STAT6 activation in fibrosis mouse models. This was less obvious in livers and lungs of Eprs-/+ mice. Conclusion: These findings suggest that during fibrosis development, EPRS plays roles in non-translational processes of ECM expression via the TGF1/STAT signaling pathway. Therefore, EPRS can be used as a potential target to develop anti-fibrosis treatments.