Regulation of Cell Migration by TM4SF5-Enriched Microdomain-Mediated Communications Between Extracellular Matrix and Acetylated Microtubule

Abstract

Membrane proteins sense extracellular cues and transduce intracellular signaling to coordinate directionality and speed during cellular migration. They are often localized to specific regions, as with lipid rafts or tetraspanin-enriched microdomains

however, the dynamic interactions of tetraspanins with diverse receptors within tetraspanin-enriched microdomains on cellular surfaces remain largely unexplored. Here, we investigated how Transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5), a membrane protein, regulate directionality cell migration by extracellular environment like extracellular matrix (ECM) and cholesterol depletion, and by intracellular signaling like microtubule modification and dynamic interaction of protein partners.

Transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5) translocates between endosomal and plasma membranes to promote cell migration, although the regulation of this trafficking remains unknown. Here, the roles of the extracellular environment and intracellular signaling in this trafficking were examined. The persistent migration of TM4SF5-expressing cells was associated with greater enrichments of TM4SF5 at the leading edges. In comparison to poly-L-lysine, cell adhesion to fibronectin enhanced the velocity and straightness of the trafficking of TM4SF5-containing vesicles toward the plasma membrane. The facilitation of trafficking was associated with tubulin acetylation and more persistent and faster cell migration. Additionally, SLAC2B suppression reduced HDAC6 activity in cells plated on fibronectin, resulting in increased tubulin acetylation, enhanced vesicle trafficking, and persistent cell migration. Thus, the results of this study show that SLAC2B regulates microtubule acetylation via interaction with HDAC6, enabling the trafficking of TM4SF5-containing vesicles to the leading membranes to promote cell migration.

Here, we investigated effects of tetraspan(in) TM4SF5 (transmembrane 4 L6 family member 5)-enriched microdomains (T5ERMs) on the directionality of cell migration. Physical association of TM4SF5 with epidermal growth factor receptor (EGFR) and integrin a5 was visualized by live fluorescence cross-correlation spectroscopy and higher-resolution microscopy at the leading edge of migratory cells, presumably forming TM4SF5-enriched microdomains. Whereas TM4SF5 and EGFR colocalized at the migrating leading region more than at the rear, TM4SF5 and integrin a5 colocalized evenly throughout cells. Cholesterol depletion and disruption in TM4SF5 post-translational modifications, including N-glycosylation and palmitoylation, alteredTM4SF5 interactions and cellular localization, which led to less cellular migration speed and directionality in 2- or 3-dimensional conditions. TM4SF5 controlled directional cellmigration and invasion, and importantly, these TM4SF5 functions were dependent on cholesterol, TM4SF5 post-translational modifications, and EGFR and integrina5 activity. Altogether, we showed that TM4SF5 dynamically interacted with EGFR and integrin a5 in migratory cells to control directionality and invasion.

Altogether, TM4SF5 containing endosome vesicles trafficked toward plasma membrane by depending on fibronectin it connected, it formed T5ERMs with EGFR and integrin α5 at leading edges to control cell migration and invasion.

막 단백질들은 세포 외부의 자극과 세포 내부의 신호전달을 감지하여 세포가 이동 할 때 속도와 방향성을 결정하게 된다. 세포의 막에는 lipid rafts 나 tetraspanin-enriched microdomain과 같은 특징적인 구역이 존재하게 되는데, 이 안에서 일어나는 receptor들의 신호전달에 따라 세포의 이동이 조절되게 된다. 본 연구에서는 막 단백질인 Transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5)가 세포 외 기질 (extracellular matrix(ECM)), cholesterol depletion 조건에 따라, 그리고 세포 내부에서는 microtubule의 상태 변화와 TM5SF5-enriched microdomains(T5ERMs)에서 결합하고 있는 단백질이 조절됨에 따라서 세포의 이동을 어떻게 조절하는지 확인 해 보았다.

먼저, TM4SF5가 endosome과 plasma membrane 사이에서 위치하면서 세포의 이동을 조절하게 되는데, 이 때에 어떻게 trafficking이 조절되는지에 대한 것은 연구가 되어 있지 않았다. TM4SF5를 과 발현 시켜서 살아있는 상태에서 현미경으로 확인 한 결과 세포의 leading edge에 TM4SF5가 많이 위치하고 있으며 이것이 세포의 지속적인 이동으로 나타나는 것을 확인 하였다. 그리고 TM4SF5를 형광으로 표지 하여 vesicle을 관찰 한 결과 vesicle의 이동 양상이 세포 부착 면에 코팅 된 ECM이 fibronectin 일 때 속도가 빠르고 직선운동을 하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이 현상이 세포 주변의 ECM에 의해 영향을 받는 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 fibronectin에 부착된 세포에 synaptotagmin-like protein lacking C2 domains B (SLAC2B)가 감소하면 histone deacetylase 6 (HDAC6)의 활성이 감소하는 것을 확인 하였고 이로 인해 tubulin의 아세틸화가 증가하게 된다. 증가된 tubulin의 아세틸화는 TM4SF5 vesicle의 이동이 빠르고 다이내믹하게 일어나게 하며 결국 세포의 이동 속도를 증가시키게 되는 것을 확인 하였다. 요약하면 SLAC2B가 HDAC6와 결합하여 HDAC6의 활성을 감소시키고, 이로 인해 tubulin의 acetylation이 증가하게 되며 TM4SF5 vesicle이 세포의 leading membrane으로 trafficking되게 하여 세포의 이동을 증가시킨다는 것을 확인 하였다.

다음으로, TM4SF5가 세포막에서 T5ERMs을 형성하여 세포의 이동을 조절하게 되는데 이 때에 epidermal growth factor receptor (EGFR)과 integrin α5가 결합하고 있는 것을 proteomic analysis를 통해서 확인 하였다. 그리고 live fluorescence-correlation spectroscopy (FCCS)를 통해 분자간의 물리적 결합이 일어나는 것을 확인 하였고, higher-resolution microscopy를 통하여 세포막의 leading edge에서 함께 존재하고 있는 것을 확인 하였다. 또한 TM4SF5와 EGFR의 결합은 세포가 나아가는 앞쪽에서 두드러지게 일어나고 integrin α5는 세포의 전면적으로 일어나는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 cholesterol depletion과 TM4SF5의 post translational modification을 일어나지 못하게 한 palmitoylation mutant, glycosylation mutant에서 TM4SF5와 EGFR, integrin α5의 결합 정도와 위치가 변화할 뿐 아니라 세포의 이동 속도와 이동의 방향성을 조절한다는 것을 2차원뿐 아니라 3차원 spheroid 배양 환경에서도 확인 할 수 있었다. 종합적으로 endosome의 TM4SF5가 세포가 부착하고 있는 fibronectin의 신호를 받아서 acetylation이 일어난 tubulin을 따라 세포막으로 trafficking되고 EGFR, integrin α5와 같은 receptor들을 만나 세포막의 leading edge에서 T5ERMs을 형성하게 되면 세포의 이동과 침윤이 일어나게 되는 것을 확인 하였다.