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성선자극호르몬분비호르몬수용체(GnRHR) 신규 리간드(GV1001)의 항전립선암 작용 : Anti-prostate cancer effect of GV1001, a novel GnRHR ligand

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Authors
김지원
Advisor
강건욱
Major
약학대학 약학과
Issue Date
2019-02
Publisher
서울대학교 대학원
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 약학대학 약학과, 2019. 2. 강건욱.
Abstract
GV1001, a 16-amino acid fragment of the human telomerase reverse transcriptase catalytic subunit (hTERT), has been developed as an injectable formulation of cancer vaccine. Here, we revealed for the first time that GV1001 is a novel ligand for gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRHR). Binding of GV1001 to GnRHR stimulated the Gαs-coupled cAMP signaling pathway and antagonized Gαq-coupled Ca2+ release by leuprolide acetate (LA), a GnRHR agonist. We then tested whether GV1001 has an inhibitory effect on tumor growth of LNCaP cells, androgen receptor–positive human prostate cancer (PCa) cells. GV1001 significantly inhibited tumor growth and induced apoptosis in LNCaP-implanted xenografts. Interestingly, mRNA expression of matrix metalloproteinase2 and matrix metalloproteinase9 was suppressed by GV1001, but not by LA. Moreover, GV1001 inhitbited the proliferaion and migration of PCa cells and induced GnRHR-dependent apoptosis.

Inhibition of androgen receptor (AR) activity or androgen deficiency is known to cause resistance of prostate cancer to anti-androgen agents. GV1001 treatment increased both cAMP/PKA-dependent AR phosphorylation and androgen-response element (ARE)-mediated transcriptional activity in LNCaP cells. The enhanced AR activation by GV1001 suppressed the cell migration ability of LNCaP cells. Although AR activity is generally considered as a major mediator of PCa growth, interaction of AR with specific coregulators can determine the fate of PCa progression such as metastasis and chemoresistance. Among diverse AR coregulators, Gene Expression Ominibus (GEO) analyses showed that YAP1 was identified as a key gene for metastasis of prostate cancer. cAMP/PKA-dependent Ser-127 phosphorylation and the subsequent ubiquitination of YAP1 were enhanced by GV1001 in LNCaP cells. Moreover, GV1001-induced YAP1 degradation inhibited its binding to AR and consequently suppressed the expression of downstream target genes of YAP1. Inhibitory effect of cell migration by GV1001 was completely reversed by overexpression of YAP5SA, constitutive active form of YAP1. Spleen-liver metastasis mouse model confirmed that liver metastasis of PCa cells implanted in spleen was significantly inhibited by GV1001 injection. Taken together, our data reveal that GV1001 is a novel ligand of GnRHR and shows anti-cancer efficacy in PCa.
항암 백신인 GV1001은 인간 텔로머라아제 역전사효소 촉매 소단위(hTERT)의 일부 16개 아미노산으로 구성된 펩타이드로 인체 면역계 중 암세포 선택적인 T세포 기능을 강화시키는 cancer vaccine이다. 최근 다양한 암종에 대해 GV1001이 항암 효능을 갖는다는 연구와 임상 결과가 보고되어 있지만, 아직까지 항암제로써 그 기능과 기전에 대한 연구는 부족하다. 전립선암은 남성에서 가장 많이 발병하는 암종이며, 암에 의한 사망의 주된 원인이다. 전립선암 치료 요법으로는 호르몬 요법, 전립선적제술, 방사선 치료 및 항암화학요법이 사용되는데 특히 호르몬 요법이 단독 혹은 병용으로 다른 치료 요법과 함께 사용된다. 전립선암의 치료가 어려운 이유는 항암제 저항성 전립선암으로 쉽게 악성화되기 때문인데, 악성화가 일어나면 빈번한 재발과 빠른 전이로 인하여 사망률이 크게 높아진다. 현재까지 이러한 전이성 전립선암에 대한 진단 마커와 치료 전략이 부족한 실정이다. 본 연구에서는 GV1001을 GnRH 수용체에 작용하는 새로운 리간드로 제시하고, 악성 전립선암에 적용 가능한 새로운 치료 약제로 규명하고자 하였다. 첫 번째, GV1001을 최초로 GnRH 수용체 리간드로서 제시하고 그 기능에 대한 연구를 진행하였다. 두 번째, 전립선암의 악성화 형태인 암세포 전이에 대한 GV1001의 기능과 기전 탐구를 통한 전립선암 치료 요법 발굴을 연구 목표로 설정하였다. GV1001의 구조 분석 결과, 펩타이드 서열 일부가 GnRH 유사체들과 중첩되는 것을 확인하였다. 이 서열은 GnRH 유사체가 수용체와 결합하는 데에 핵심적인 역할을 담당하고 있을 것으로 예측되어 GV1001이 GnRH 수용체와 결합하는지 확인하였고, 결과적으로 GnRH 수용체와 결합하여 하위 신호 전달을 매개하고 있음을 관찰하였다. 또한, 대표적인 GnRH 유사체인 leuprolide acetate(LA)와 비교하였을 때, LA 처치에 의하여 GnRH 수용체 주요 하위 전달 신호인 Gαq-칼슘 분비가 증가한 반면 GV1001 처치에 의하여 부차적인 하위 전달 신호인 Gαs-cAMP 신호가 활성화 되는 것을 관찰할 수 있었다. LA와 GV1001는 또한 경쟁적으로 상호 신호 전달을 억제하였으며, 이러한 신호 전달은 GnRH 수용체에 의존적으로 관찰되었다. GV1001의 GnRH 수용체 매개 전립선암 억제 효과를 평가하기 위해 동물 실험과 세포 실험을 진행하였다. GV1001을 반복하여 투여했을 때, 누드 마우스의 혈중 테스토스테론 수치가 현저히 감소하였으며, 정액 소포 무게가 유의하게 감소하였다. 또한, GV1001 처치에 의해 전립선암 이종 이식 누드 마우스 모델에서 LNCaP 세포주 종양의 부피가 감소하였으며 종양 내 세포자가사멸 마커의 유도와 세포증식 마커의 억제가 관찰되었다. 암세포 전이 유도 인자인 MMP2, MMP9의 종양 내 mRNA 발현 수준을 평가한 결과 GV1001 처치에 의해 MMP2, MMP9의 mRNA 발현 수준이 억제되는 것을 확인하였다. 세포 실험에서 GV1001 처치에 의해 LNCaP과 PC-3 세포주 증식이 감소되었으며, Transwell-세포 이동능 평가 결과에서도 LNCaP과 PC-3-세포주 이동능이 감소하였다. 또한, LNCaP과 PC-3 세포주 내의 세포자가사멸 유도 효과가 관찰되었다. GV1001의 세포자가사멸 유도 효과는 GnRH 수용체에 의존적으로 관찰되었다. 이러한 GV1001의 암세포 발현-GnRH 수용체에 대한 직접적인 암세포 억제 효과가 생체 내에서 관찰되는지 평가하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 도입한 LNCaP 전립선암 세포주를 구축하여 이종 이식 누드 마우스 모델을 구축하였다. 그 결과, GV1001 처치에도 GnRH 수용체 편집 LNCaP 세포주 종양의 부피가 유의하게 감소하지 않았다. 이러한 결과는 GV1001의 전립선 종양 억제 효과가 뇌하수체 호르몬 분비 세포 및 암세포 자체에 발현된 GnRH 수용체 모두를 경유하여 나타나는 효과임을 시사한다. 전립선암 이종 이식 누드 마우스 모델에서 GV1001은 종양 내 MMP2, MMP9의 mRNA 발현 수준을 억제하였으며, LNCaP, PC-3 세포주의 이동능을 감소시킨 바 있다. 이러한 세포 이동능 및 전이에 미치는 GV1001의 영향에 대해 탐구하기 위해 세포 표현형 변화를 관찰하였다. GV1001의 처치는 LNCaP 세포의 상피간엽전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT)을 억제하였다. 또한, ultra-low attachment surface plate 에서 배양된 LNCaP 세포의 구 형성능이 GV1001 처치에 의해 억제되는 것을 관찰하였다. 전립선암 세포의 세포 표현형 및 이동능에 미치는 GV1001의 영향이 결과적으로 생체 내에서 다른 장기로의 전이를 억제할 수 있는지 비장-간 전이 마우스 병리 모델(spleen-liver metastasis)을 통해 평가하였다. 비장에 LNCaP 세포를 주입한 후 GV1001을 처치하였을 때, 간 전이 발생 빈도와 종양 면적이 모두 감소되는 것을 확인하였다. 안드로겐 결핍이나 AR 활성 저해는 전립선암의 항-안드로겐 약제에 대한 저항성의 원인이 되고 다양한 발암원성 신호전달을 촉진하는 것으로 알려져있다. GV1001의 전립선암 억제, 특히 이동능의 억제에 AR 활성이 영향을 미치는지 평가하였고, AR의 Gαs-cAMP 신호 의존적 활성화가 관찰되었다. GV1001의 처치에 의해 LNCaP-세포주 내 AR의 인산화와 androgen-response element(ARE) 매개 전사활성이 증가하는 것을 western blot assay와 luciferase assay를 통해 관찰하였다. 이러한 AR 활성화 및 AR 발현 증가는 LNCaP 세포주의 세포 이동능을 억제했다. AR 활성은 일반적으로 전립선암의 증식을 매개하는 주요 인자로 알려져 있으나, 전이 억제를 유도하는 기전을 탐구하기 위해 AR과 결합하는 보조활성자의 역할을 규명하고자 하였다. AR 결합 보조활성자와 GnRH 수용체 하위 전달 신호 중 Gαs-cAMP 신호 특이적 활성화의 연관성을 평가하기 위해 전립선암 환자의 전이와 관련된 유전자 발현을 분석하였고 핵심 유전자로 YAP1을 도출하였다. 세포 실험을 통해 GV1001 처치에 의한 YAP1의 인산화, 세포질 내 축적 및 유비퀴틴화-단백분해효소 활성화를 관찰하였다. YAP1의 분해에 따라 AR과의 결합이 저해되고 YAP1 의존적 타겟 유전자의 발현이 억제되었다. 또한, YAP1 타겟 유전자의 프로모터 부위에 대한 AR의 결합능 역시 억제되는 것이 관찰되었다. 이러한 YAP1의 활성 억제 효과는 GV1001의 Gαs-cAMP 신호 의존적으로 관찰되었다. 세포 전이 실험을 통해 GV1001의 Gαs-cAMP 신호 의존적 YAP1 활성 억제가 세포 전이를 억제하고 있음을 확인하였다. 전립선암 세포의 성장과 전이에 미치는 YAP1의 역할을 평가하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 도입한 YAP1 편집 LNCaP 세포주를 구축하였다. YAP1 편집 LNCaP 세포주는 세포의 이동능이 대조군 LNCaP 세포주에 비하여 현저하게 억제되어 있었으며, 누드 마우스 모델에서 종양의 성장이 대조군 LNCaP 세포주 종양에 비하여 유의하게 느린 것을 관찰하였다. 또한, YAP1 편집 LNCaP 세포주에서 GV1001에 의한 세포 이동능 억제 효과는 관찰되지 않았다. 활성화된 YAP1은 핵 내에 존재하여 다양한 발암원성 유전자들의 전사를 촉진하는 전사 인자로 작용한다. 활성화 YAP1의 발현을 촉진(constitutive active)하는 형태인 YAP5SA를 과발현시킨 후 YAP1의 과활성이 미치는 영향을 평가하고자 하였다. YAP1 편집 LNCaP 세포주와 반대로 YAP5SA 발현 LNCaP 세포주는 대조군 LNCaP 세포주에 비하여 세포의 이동능이 현저하게 증가되어 있었다. 그러나, YAP1 편집 LNCaP 세포주와 마찬가지로, GV1001에 의한 세포 이동능 억제 효과는 YAP5SA 발현 LNCaP 세포주에서도 관찰되지 않았다. 종합하여 볼 때, 본 연구에서 규명한 GV1001의 GnRH 수용체 리간드로써의 역할은 Gαs-cAMP 신호의 선택적 활성화이며 Gαs-cAMP 신호 전달을 통해 YAP1의 활성 억제와 AR의 활성화가 유도되는 것을 확인하였다. AR-YAP1 결합은 AR 활성화에 따른 전이 촉진의 주요한 인자이고, 이를 저해했을 때 전이 억제 효과가 관찰된다. 따라서 전립선암의 악성화를 제어하는 새로운 타겟으로 YAP1을 제시하며, 이를 활용하면 기존 호르몬 치료제의 저항성 매개 기전을 이해하고 전립선암의 새로운 치료 방안을 도출할 수 있을 것으로 기대된다.
Language
kor
URI
https://hdl.handle.net/10371/152538
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College of Pharmacy (약학대학)Dept. of Pharmacy (약학과)Theses (Ph.D. / Sc.D._약학과)
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