Radiation-Induced Somatic Mutations by Whole Genome Sequencing from Normal Organoids

Abstract

목적:

본 연구진은 전리방사선 중 하나인 감마선이 유발하는 성체줄기세포 내 체성돌연변이의 패턴 및 방사선량과의 관련성을 평가하는 연구를 수행하였다. 조직특이적 성체줄기세포를 오가노이드 배양기술을 적용하여 실험실내 배양을 수행하였고, 전리방사선 피폭 후 유발된 체성돌연변이의 정량적 평가를 위해 배양된 오가노이드의 전장유전체 분석을 수행하였다.

방법:

정상 C57BL/6 암컷 쥐의 췌장과 유선조직에서 성체줄기세포를 분리하여 알려진 조직특이적 성장인자들의 조합을 이용한 실험실내 오가노이드 배양을 수행하였고 단일 오가노이드의 선택적 배양을 통해 클론 오가노이드를 확립하였다. 배양된 오가노이드를 단일세포로 분리 후 감마선 조사기를 이용하여 1-10 Gy 의 감마선을 오가노이드에 조사하였다. 방사선 피폭에 따른 오가노이드의 생존분석을 수행하였다. 방사선 조사 후 오가노이드를 형광 유세포 계측기술을 이용하여 단일세포로 분리하고 재배양하였다. 방사선 피폭 후 생존한 클론 오가노이드의 DNA를 추출하여 30X 범위 전장유전체서열분석을 수행하였다. 얻어진 염기서열을 토대로 방사선에 의해 유발된 체성돌연변이를 각각 염색체 결실, 염색체 구조이상, 단일염기서열변이, 이중염기서열 변이, 군집돌연변이로 분류하고 이의 정량적, 정성적 분석을 수행하였다. 방사선이 미치는 오가노이드 내 신호전달 체계의 변화를 확인하기 위해 2 Gy의 감마선을 췌장 오가노이드에 조사 후 시간의 흐름에 따라 (0 h, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h) 오가노이드 내 전체 RNA를 수집하였다. 방사선에 반응하는 중요한 유전자들의 발현 차이 여부를 통해 방사선 특이 유전자들을 확인하였고 이를 바탕으로 방사선에 의해 활성화된 분자 기전을 탐색하였다.

결과:

정상 쥐에서 유래한 췌장, 유선 오가노이드의 배양 및 클론 오가노이드의 확립을 성공하였고 개별 오가노이드에 특이적인 단일염기서열 변이를 이용하여 클론 오가노이드 여부를 확인하였다. 유선 오가노이드 (1 Gy 전후에서 50% 생존 확인)는 췌장 오가노이드 (4 Gy 전후에서 50% 생존 확인)에 비해 좀더 방사선에 민감한 경향을 보였다. 6개의 췌장 오가노이드 전장유전체 분석 결과 1개의 2 Gy 피폭을 받은 표본에서 4번 염색체의 결실이 확인되었다. 염색체 구조이상의 전체 양은 방사선량이 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였으며 2 Gy 이상의 피폭을 받은 경우에 급격하게 증가하는 양상이었다. 유전체의 복제수 변화를 수반하지 않는 균형적 구조적 이상은 방사선에 의해 유발되는 특이적인 형태의 구조이상으로 2 Gy 이상의 피폭을 받은 표본에서 높은 빈도로 발견되었다. 표본 내 단일염기서열변이의 양은 췌장 오가노이드 분석의 결과 피폭방사선량의 증가와의 관련성이 낮았으나 이중염기서열변이의 양은 피폭방사선량이 증가함에 따라 증가하는 양상을 보였다. 유전체 내 비반복서열 부위에서 발견되는 작은 크기의 염색체 제거 및 삽입 (indel)은 2 Gy 이상의 방사선 피폭을 받은 표본 내에서 증가하는 양상을 보였다. 군집돌연변이 서열을 토대로 한 체성돌연변이 패턴 (mutational signature) 분석은 C>T의 변이에 특징적인 형태를 보였다. 손상된 DNA 복구 기전과 방사선 유발 손상에 좀 더 특이적인 DNA 손상 복구 기전에 참여하는 유전자들이 방사선 조사 후 2 h 이후에서부터 증가하였다. 방사선에 의해 활성화되는 신호전달 체계에서는 DNA 복구 기전 (NES 1.4, FDR q value 0.060) 뿐만 아니라 Myc 표적 기전 (NES 2.08, FDR q value <0.01)이 활성화되었고 이는 방사선에 의한 유전체 불안정성에 관련이 있을 것으로 추정되었다.

결론:

조직 특이적인 성체줄기세포의 오가노이드 배양을 수행하였고 이를 감마선의 체성돌연변이 유발 평가연구에 적용하였다. 유선조직 유래 성체줄기세포는 췌장 유래 성체줄기세포에 비해 좀 더 방사선 민감성을 보였다. 피폭방사선량이 증가함에 따라 특정한 형태의 염색체 구조변이 (결실, 균형적 구조이상, 복합구조이상)의 양이 증가하였으며 이는 방사선에 의해 유발된 염색체 구조변이임을 시사하였다. 방사선에 피폭된 오가노이드 유전체 내 군집돌연변이의 분석을 통해 방사선에 의해 유발된 mutational signature의 한 형태 (이중뉴클레오티드다형성)를 확인할 수 있었다. 오가노이드를 이용한 방사선 유발 체성돌연변이의 분석을 통해 이후 방사선의 발암유발 기전에 대해 깊이 이해하고 이를 인체 연구에 적용할 수 있는 가능성을 보았다.

Purpose:

The aim of our study was to analyze the mutational signatures induced by gamma-radiation and its possible correlation with radiation-induced carcinogenesis. For measuring somatic mutational load in the genomes of cells, 3D organoid culture technique is adapted with normal mouse pancreas and breast adult stem cells (ASCs). Quantification of DNA damages by ionizing radiation (IR) is assessed by de novo whole genome sequencing (WGS) techniques.

Materials and methods:

ASCs in pancreas duct and mammary fat pad were isolated from normal C57BL/6 female mice. In vitro 3D organoid cultures of ASCs were performed using tissue-specific growth factor cocktails. Clonal organoid lines were generated by expansion of single organoid. For irradiation, cultured organoids were dissociated and irradiated under various dose (1-10 Gy) of gamma-ray using gamma-irradiator. Viability assay for IR were performed. After irradiation, organoids were dissociated as single cells using flow cytometry and cultured. Clonal irradiated organoids were established by expansion of single irradiated organoid. WGS of mouse germline, clonal ancestor organoid and irradiated organoids were performed using Illumina sequencers to a depth of 30× coverage. Clonality of organoids were determined using quantitation of organoid-specific single nucleotide variations (SNVs). The pipelines for analyzing copy number variations of chromosomal arm level, structural variations (SVs), small insertion and deletions (indels), double nucleotide variations (DNVs) and clustered mutations were constructed. Temporal change of Transcriptomes were evaluated using pancreas organoid at 0 h, 30 min, 2 h, 6 h and 24 h after 2Gy irradiation. Expression of significant radiation-responsible genes were monitored and pathway analysis for detecting radiation-induced cell response was performed.

Results:

Organoids of normal mouse pancreas and breast were successfully established. Clonal organoid lines were generated and confirmed. The survival rate of organoids showed IR dose-dependent relationship. Breast organoids showed relative radiosensitive feature which was approximate lethal dose of 50% survival (LD50) around 1 Gy than pancreas organoids (approximate LD50 around 4 Gy). Among the 6 samples, 1 of 2 Gy-irradiated organoid showed one copy loss of chromosome 4. The total amount of SVs increased with dose-dependent manner and abruptly increased over 2 Gy. Balanced-type SVs which are regarded as IR-related form were frequently noted in high-dose (≥2 Gy) irradiated organoids. The amount of SNVs showed no significant relationship with irradiation in pancreas samples. However, the amount of DNVs increased with dose-dependent manner. Small indels located in non-replicative genome area tended to be more frequent in high-dose (≥ 2Gy) samples. Mutational signatures based on clustered mutations characterized by C>T mutations. Critical genes involving DNA repair pathway including non-homologous end-joining pathway were activated after 2 h of 2 Gy irradiation. On pathway analysis, DNA repair mechanism was activated (normalized enrichment score 1.41, FDR q value 0.060). Furthermore, myc-target pathway was also enriched (normalized enrichment score 2.08, FDR q value <0.01) which might be related to increase of genomic instability.

Conclusions:

3D Organoid cultures for tissue-specific ASCs were adapted for studying gamma radiation-induced somatic mutations. The pancreas and breast organoids showed different survival rates in IR. IR-related chromosomal SVs including deletion, balanced inversion, translocation and complex SVs were found in irradiated organoid genome with dose-dependent manner. IR-induced clustered DNA damages such as DNVs could be represented as mutational signatures by IR. Future studies for analyzing IR-induced somatic mutation could reveal the mechanism of radiation-induced carcinogenesis in human body.