Development of genetically encoded fluorescent sensors to study cellular neurophysiology

Abstract

Optical sensors of cellular neurophysiology have thrived to a level where they can enable probing the voltage change of dendritic spines or neuronal activities from electrophysiologically indistinguishable cell types in a small region. The on-going success of optical recording was achieved by a combination of genetic engineering, optimization of optics for biological imaging, and the development of advanced fluorescent sensors. The emergence of genetically encoded fluorescent bio-sensors facilitated cell-type specific targeting of the optical sensors by employing the cell of interests own protein production machinery.

This dissertation will discuss rationally designed strategies to develop genetically encoded voltage indicators, to optimize membrane trafficking of the sensor molecules, and to modify fluorescent proteins property to confer photoactivatability.

Recording voltage is a direct measurement of neuronal activity. Genetically encoded voltage indicators were first reported in 1997 and had shown considerable improvements in the last seven years. The first part of this thesis paper will introduce the basic concepts and a brief history in genetically encoded voltage indicator development.

One of the main advantages of using a genetically encoded optical sensor is the ability to send the proteins to specific regions, even subcellular. Therefore, means to better locate the sensor proteins were empirically studied and will be discussed in the second part.

Finally, a set of rationally designed mutations to make a sensor protein optically highlightable will be shown. Previous results from the report of the first photoactivatable green fluorescent protein were applied to develop photoactivatable genetically encoded voltage indicators and pH indicators.

광학 센서들의 눈부신 발전으로 인해 세포신경생리학 연구에 있어 전기생리학적으로는 밝혀내기 어려운 정보의 습득에도 이러한 광센서들이 사용되고 있다. 예를 들면, 신경 세포 dendritic spine의 전기적인 신호 변화나 혹은 한 지역에 있으나 전기적으로는 구별해 내기 힘든 서로 다른 세포들을 구분해 내어 광학적으로 그 활성을 측정하는데 활용되고 있다. 이러한 광학 센서의 성공은 생명공학 기술의 발전, 생물 실험에 최적화된 광학 장비 그리고 향상된 수준의 형광 센서 개발에 기인한다. 특히, 유전적으로 부호화된 형광 바이오센서들의 출현은 조사하려는 세포 자체의 단백질 생산 메커니즘을 사용함으로써 광학 센서의 세포 유형별 표적화를 가능하게 하였다.

본 학위 논문은 유전자 부호화 전압 표시장치를 개발하고, 센서 분자의 세포막 발현을 최적화하며, 또한 형광 단백질의 광활성화를 가능케 하는 방법을 다루고 있다.

신경세포의 전압변화를 측정하는 것은 곧 신경 활동을 직접 측정한다는 것을 의미한다. 유전자 부호화된 전압 표시장치는 1997년에 처음 보고되었는데, 특히 지난 7년간 눈부신 발전을 이뤄왔다. 이 학위 논문의 첫 번째 부분에서는 유전자 부호화된 전압 표시장치의 기본 개념과 그간의 개발 이력을 간략히 소개함과 동시에 이번 연구에서 새롭게 개발한 전압 표시장치를 소개하고 있다.

유전적으로 암호화된 광학 센서의 주요 장점 중 하나는 해당 단백질을 특정 지역, 더 나아가 세포 소기관으로 보내는 표적 능력이다. 따라서, 센서 단백질을 특정한 위치에 더 잘 발현 시키기 위한 수단들을 경험적으로 연구하였고, 이 또한 이 논문의 두 번째 부분에서 논의될 것이다.

마지막으로, 센서 단백질을 광학적으로 활성화하기 위해 설계된 논리적 돌연변이 전략을 소개한다. 이 부분에서는 2002년에 처음 보고된 광활성이 가능한 녹색 형광 단백질의 개발에 사용된 전략을 적극적으로 활용하였다. 이를 통하여 광활성화가 가능한 유전자 부호화된 전압 표시장치 및 산성도 표시장치를 개발한 과정과 결과를 소개한다.