Genomic and transcriptomic landscape of two-step malignant transformation in x-irradiated C3H10T1/2 cells

Abstract

Tumourigenesis is initiated by various factors and its progression is also affected by numerous elements. In 1980, Little and Kennedy performed malignant cell transformation experiment using x-irradiation to study the initiation and progression of tumourigenesis. Reproducing tumourigenesis in vitro is challenging, yet, they accomplished the task and almost 40 years later, I am here to elucidate unsolved questions beneath that experiment. Firstly, genomic alterations were investigated using whole-genome sequencing. Although malignant transformation process is a recreation of tumourigenesis in vitro, the genomic alterations were not as striking as I expected which was very intriguing. The generation of focus definitely implied the presence of DNA damage, yet the changes occurred at this stage were not quite evolved. I then studied transcriptome changes that arose due to x-irradiation. Using principal component analysis and admixture analysis, I illustrated that the transcriptome profiles were distinctively differed according to x-irradiation or focus generation status. To investigate what drives focus generation, I analysed differentially expressed genes between un-irradiated cells and irradiated but non-focus cells. Non-focus cells seemed to be at the initial stage of malignant transformation as its characteristics were closer to focus rather than un-irradiated cells. Particularly, non-focus cells exhibited highly elevated Cdkn1a, a DNA damage response gene, possibly to respond to DNA damage by x-irradiation. Also, down-regulation of TGF-b genes were observed in non-focus cells which may be one of the factors that induce focus generation. Moreover, DNA repair related genes including Atm, Atr, Brca1, Brca2, and Chek1 were highly elevated in focus cells. This study described that alterations due to x-irradiation in transcriptome were quite dramatic whereas changes in genome was rather gentle. Furthermore, as stem cells are frequently involved in malignant transformation, whether Focus possesses stem cell-like characteristics was examined. As a result, Focus displayed stemness and up-regulated Myc contributed to oncogenic reprogramming hence generated Focus cells with tumourigenic characteristics. In conclusion, I speculated that there are three factors involved in the second step of two-step malignant transformation. The primary factor would be down-regulated Tgfb gene expression. The change occurred in Non-focus, which is considered as at the very early stage of tumourigenesis. Decreased Tgf gene expression led the cells to transform further, hence induced DNA repair process especially error-prone DNA repair which would act as the secondary factor. Lastly, with up-regulated Myc oncogene, the cells were reprogrammed into cancer stem cell, hence generated foci with malignancy. Also, Focus cells exhibited stem cell-like characteristics. Taken together, in this study, I uncovered three factors that contributed to the second step of two-step malignant transformation and I believe that these findings will extend the understanding of tumourigenesis.

종양의 발생과 진화는 다양한 종류의 변이에 의해 활성화 된다. 1980년, Little과 Kennedy는 종양으로 되는 단계인 세포의 형질전환을 초래하는 요인들을 밝히고자 C3H10T1/2 세포주에서 엑스레이를 이용하여 실험을 진행하였다. Little은 two-step 이론을 제시하며 세포에서 x-선 조사로 인해 유도되는 세포의 형질전환은 두 종류의 인자에 의해 일어난다고 제안하였다. 두 종류의 인자 중 첫 번째 인자는 x-선 조사였으나 두 번째 인자에 대해서는 자세하게 밝혀내지 못하였다. 40년의 세월이 지난 오늘날, 본 연구에서는 차세대 염기서열 분석 기법을 이용하여 1980년대에 미처 밝히지 못했던 형질전환을 초래하는 유전자군에 대해 밝히고자 하였다. 먼저, 전장 유전체 분석 기법을 이용하여 x-선 조사로 유도된 focus 형성과 유전형질의 변환과의 관계를 알아보고자 하였다. X-선이 조사 되었으나 focus를 형성하지 않은 세포 (Non-focus) 와 focus가 형성된 세포 (Focus) 의 유전체 복제수 변이, 돌연변이 발생 원인에 따른 고유한 특징 및 종양변이부담을 분석하였다. 그 결과 focus를 형성하더라도 x-선이 조사된 focus를 형성하지 않은 세포에 비해 유전체의 변화는 크게 없는 것이 관찰되었으며 x-선 조사가 유전체 변이에 큰 영향은 주지 않는 것을 알 수 있었다. 그리하여 본 연구에서는 전사체 분석 기법을 이용하여 x-선 조사로 유도된 focus 형성에 관여하는 유전자 발현 패턴 변화를 연구해보고자 하였다. 주성분 분석과 admixture 분석 결과는 focus 형성 여부에 따라 전사체 패턴이 달라짐을 보여주었으며 focus 형성을 유도하는 인자를 차별발현 유전자 분석을 이용하여 규명하고자 하였다. X-선이 조사되지 않은 컨트롤군과 Non-focus군의 유전자 발현량과 패턴의 차이가 대조되었으며 그 결과, Non-focus군은 엑스레이로 유도된 형질변형 과정의 가장 초기단계에 있다는 것을 설명할 수 있었다. 또한, Non-focus군의 전사체 기질이 컨트롤군 보다는 Focus군에 더 가깝다는 것도 밝혀졌다. 특히, Non-focus군에서는 DNA 손상반응 유전자로 잘 알려진 Cdkn1a가 엑스레이로 인한 DNA 손상에 대한 반응 작용으로 발현량이 매우 높게 올라간 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 focus 형성에 기여하는 인자로 생각되는 TGF-b 유전자들이 Non-focus군에서 발현이 떨어진 것을 관찰할 수 있었다. 게다가 DNA 회복 시스템 관련 유전자로 알려진 Atm, Atr, Brca1, Brca2, 그리고 Chek1 유전자들의 발현이 Focus군에서 매우 높게 올라간 것을 알 수 있었다. DNA 회복 시스템이 Focus군에서 전반적으로 많이 올라갔지만 특히, error-prone DNA 회복 시스템이 Focus군에서 높게 올라간 것을 볼 수 있었다. 세포가 외부 자극에 의해 손상을 입었을 경우, error-free 시스템이 먼저 작동을 하고 error-free 시스템이 과부하가 되었을 경우 error-prone 시스템이 가동이 된다. 본 연구 결과에서도 error-prone 시스템이 올라간 것을 관찰할 수 있었는데 error-prone 시스템에 의해 손상된 DNA가 회복이 되어 결국 제대로 회복이 되지 않고 마침내 focus를 형성하는 것으로 생각이 된다. Focus 형성에 따른 유전체 변화는 뚜렷하지 않았으나 전사체의 변화는 매우 극명하게 나타나는 것을 유전자 발현 패턴 변화 연구를 통해 알 수 있었다. 이는 암 유전체 진화적인 관점에서 볼 때, 유전체의 변화에 앞서 전사체의 변화가 1차적으로 먼저 일어나는 경우도 있다는 것을 시사한다. 마지막으로 선행연구 중 종양 발생과 줄기세포가 밀접한 연관이 있다는 보고가 있었다. 이를 바탕으로 Focus가 stem cell-like 성질이 있는지를 관찰하였고 그 결과, Focus는 stemness가 있는 것을 확인하였다. 또한 up-regulated된 Myc 유전자가 세포를 reprogramming 할 수 있다는 보고가 있었으며 Myc으로 유도된 종양은 유전체의 변화가 크게 없다고 하였다. Focus는 Myc의 발현이 올라가 있었으며 유전체의 변화 역시 크지 않았음으로 그 결과가 선행연구와 일치한다. 본 연구의 결과를 종합해보면 Little이 제시한 two-step 형질전환 이론에서 두 번째 단계에 관여하는 인자는 두 가지가 있는데 첫 번째로는 Tgfb 유전자의 발현이 떨어지는 것이고 두 번째로는 올라간 error-prone DNA 회복 시스템이다. 아주 이른 시기의 종양 세포에서처럼 Non-focus군에서 Tgfb 유전자의 발현이 떨어짐으로써 Non-focus 세포가 Focus 세포로 형질전환이 일어나는 것에 기여를 하였고 error-prone DNA 회복 시스템이 가동됨에 의해 제대로 복구 되지 않은 세포들이 누적이 되어 결국 focus를 형성하였다. 그리고 마지막으로 Focus가 갖고 있는 stem cell-like 성질과 Myc으로 유도된 oncogenic reprogramming으로 인해 transformed cell인 Focus가 malignancy를 갖게 된다고 생각할 수 있다. 따라서 Little의 two-step 형질전환 이론을 정확히 밝혀냄으로써 본 연구를 통해 종양 발생에 대한 이해도가 높아질 것으로 예상된다.