Effective control of neuropathic pain by hepatocyte growth factor transiently expressed from naked plasmid DNA

Abstract

인간 간세포 성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF)는 혈관 신생, 세포 분열 및 형태 형성 등 다(多)기능을 가지는 단백질이다. 또한 간세포 성장인자는 신경계의 생존과 발달에 기여하는 신경인자 (neurotrophic factor)로도 잘 알려져 있다. 이러한 특성은 이 성장인자가 신경계와 관련된 질병들을 이해하고, 나아가 이를 극복하는 데도 사용할 수 있는 가능성을 제시한다. 이 연구에 앞서 인간 간세포 성장인자를 발현하는 플라스미드 DNA 벡터 (pCK-HGF-X7 혹은 VM202)를 이용하여 통증성 당뇨병성 신경병증(painful diabetic peripheral neuropathy, PDPN) 환자를 대상으로 임상 1상과 2상이 진행된 바 있었는데, 이때 pCK-HGF-X7이 장기간 동안 매우 효과적으로 진통효과를 나타내었고 약물 관련 부작용도 발견되지 않았다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 pCK-HGF-X7가 어떠한 메커니즘을 통하여 진통 효과를 나타내는지 동물 모델을 이용하여 명확하게 조사하고자 하였다.

pCK-HGF-X7이 어떻게 신경병성 통증 완화에 기여하는지를 조사하기 위하여 만성 수축 상해(chronic constriction injury

CCI) 모델을 이용하였다. CCI 수술을 가한 뒤, 200ug의 pCK-HGF-X7을 근육 투여한 후, 적정 시간에 기계적 이질통 (von Frey filament assay)과 열 통각 과민반응 (thermal hyperalgesia)을 측정하는 행동 실험을 수행하였다. CCI 수술을 유도한 군에서는 대조군에 비해서 von Frey hair을 통한 자극에 아주 민감한 반응을 보인 반면, pCK-HGF-X7을 투여한 군에서는 자극에 의한 양성반응이 감소하는 현상을 관찰하였다. 흥미롭게도 pCK-HGF-X7을 3주 또는 4주 이후에 한번 더 투여한 경우에는 신경병성 통증이 더욱 더 높은 수준으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 streptozotocin을 투여하여 당뇨 증상을 유발한 쥐에서도 신경병성 통증이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 pCK-HGF-X7이 다양한 통증모델에서 통증 완화 효과를 보인다는 것을 의미한다.

위에서 관찰된 진통 효과를 분자적 수준에서 이해하기 위해 microarray 분석을 실시하였다. 총 4만여개의 유전자를 분석한 결과 신경 손상과 pCK-HGF-X7으로 인하여 변화된 유전자가 45개가 있음을 확인하였다. 이 중에서 통증 연구에서 가장 중요한 지표로 사용되고 있는 3가지 유전자, ATF3 (Activating transcription factor 3, ATF3), 전위 의존성 칼슘채널의 소단위 알파-2-델타-1(α2δ1), 세로토닌 재흡수 운반체 (5-HTT)를 선별하여 집중 분석하였다. CCI 모델에서 이 3가지의 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 이것이 pCK-HGF-X7 주사군에서 현저하게 감소함을 확인하였다. 이를 통해 pCK-HGF-X7가 신경 손상 시 통증 유발 인자들의 발현을 억제함으로써 진통 효과에 크게 기여한다고 유추할 수 있었다.

위의 microarray 분석 결과 nociceptor의 민감도를 증진시키는 염증성 사이토카인과 케모카인들의 유전자 발현도 변화함을 관찰 할 수 있었다. 이를 CCI 생쥐 모델에서 확인한 결과, pCK-HGF-X7은 신경 손상으로 인해 유도된 CSF1과 IL-6의 발현을 시켰고 척수의 소교세포와 성상세포들의 활성화도 억제하였다. 이는 pCK-HGF-X7이 CCI 모델에서 염증성 지표들의 발현을 변화시키고, 척수의 특성을 변화시켜 신경병성 통증 완화에 기여함을 의미한다.

이러한 간세포 성장인자의 항염증 효과는 in vitro 실험에서도 확인할 수 있었다. 감각신경 및 슈반세포에 LPS (lipopolysaccharide)를 처리하여 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, and TNF-α)의 유전자 발현을 농도 의존적으로 증가시키고, 이때 간세포 성장인자를 가하면 이러한 인자들의 발현이 억제됨을 관찰하였다. 이는 c-Met의 하위 신호 전달 매개자인 ERK의 인산화를 증가시킴으로써 HGF가 항염증 효과를 나타내는 것을 의미한다. 이는 HGF가 감각신경 및 슈반세포에 작용하여 항염증 효과를 나타내고 이것이 통증완화 효과에 기여할 수 있음을 의미한다.

본 연구를 통해 pCK-HGF-X7가 CCI를 통해 증가한 통증 유발 인자들, 특히 염증인자들의 발현을 억제하여 진통 효과를 나타내는 것을 밝혔다. 이 결과는 그간 임상 1상 및 2상 실험에서 관찰된 pCK-HGF-X7의 강력하고 장기적인 통증 완화 효과와도 일치하는 것으로서 HGF가 각종 신경계 질환에 사용될 수 있다는 가능성을 강력하게 제시하였다는 점에서 의미가 크다고 할 수 있다.

Abstract

Neuropathic pain is caused by pathological insults within the somatosensory nervous system, including peripheral fibers and central neurons. Neuropathic pain is associated with abnormal perception of pain including allodynia and hyperalgesia. Many people worldwide suffer from this devastating diseases, yet it still remains to be a great burden to the society and patients for its pathologic mechanisms are poorly understood. There are few current treatment options for neuropathic pain with limited efficacy and significant adverse effects. Therefore, there is a great need in the development of new investigational drug for the treatment of neuropathic pain.

In an effort to develop an effective treatment method for painful neuropathy, I have explored the possibility of using plasmid expression human hepatocyte growth factor (HGF). HGF is a multifunctional protein containing angiogenic and neurotrophic properties. In this study, I investigated the analgesic effects of HGF using a plasmid vector engineered to co-express two isoforms of human HGF, pCK-HGF-X7 (or VM202), in a chronic constriction nerve injury (CCI)-induced mouse neuropathic pain model. Intramuscular injection (i.m.) of pCK-HGF-X7 into proximal thigh muscle induced expression of HGF in the muscle, and sciatic nerve. This gene transfer procedure significantly attenuated mechanical allodynia and thermal hyperalgesia in mouse CCI model. A single i.m. injection of pCK-HGF-X7 was able to reduce neuropathic pain for up to 8 weeks. Furthermore, the injury-induced expression of activating transcription factor (ATF3), calcium channel subunit α2δ1, and serotonin reuptake transporter (5-HTT) was significantly suppressed. These results suggest that pCK-HGF-X7 effectively attenuates CCI-induced neuropathic pain, and inhibits the expression of pain-related genes such as ATF3, α2δ1, and 5-HTT.

Complex neuroinflammatory responses within the peripheral and central nervous system is another key mechanism that are involved in the development and maintenance of neuropathic pain. Inflammatory mediators including cytokines and chemokines are released to promote undesirable sensitization of nociceptors generating pain symptoms. Here, the role of HGF in the regulation of inflammatory responses were investigated. It was shown that pCK-HGF-X7 successfully reduces the expression of CCI-induced IL-6 and CSF1 in the ipsilateral DRG neurons. In addition, the decreased CSF1 expression in the ipsilateral DRG neurons by pCK-HGF-X7 treatment was accompanied with a noticeable suppression of the nerve injury-induced glial cell activation in the spinal cord dorsal horn. Further investigation using primary sensory neurons and schwann cells revealed that HGF suppresses LPS-induced production of pro-inflammatory cytokines including IL-1β, IL-6, and TNF-α. Taken together, these results suggest that HGF downregulates the expression of pain-causing inflammatory cytokines, and thereby effectively ameliorating neuropathic pain.

In this thesis work, I have identified the anti-nociceptive effect of pCK-HGF-X7 in CCI-induced neuropathic pain model, and that it downregulates injury/pain-causing factors within the peripheral and central nervous system. This is the first study to clearly prove the possibility of using pCK-HGF-X7 as a therapeutic agent for neuropathic pain in animal models. The findings from this thesis may provide insights into the development of innovative therapeutic agent for neuropathic pain, and also the potential use of gene therapy as tool for treating certain diseases.