Molecular Characterization of Immunomodulatory Activities of PG102, a Water-Soluble Extract from Actinidia arguta, in Skin Inflammation

Abstract

다래 (Actinidia arguta)로부터 열수 추출한 PG102는 다양한 세포 및 동물 질병 모델에서 강력한 항염증 및 항산화 활성을 보였다. PG102의 보고된 효과들을 바탕으로 본 연구에서는 염증성 피부질환의 한 종류인 건선에 대한 PG102의 면역조절 효과를 연구했다. 이 때 이미퀴모드로 유도한 마우스 건선 모델과 피부각질세포주 HaCaT을 이용해 PG102의 활성을 분자생물학적으로 이해하고, 나아가 PG102의 분획을 통해 가장 높은 활성을 가진 분획물을 분리하기 위한 실험을 수행하였다.

PG102의 활성을 먼저 이미퀴모드로 유도한 건선 모델에서 관찰했다. PG102의 국소도포는 피부 두께 증가를 억제하고 배수림프절 및 혈청에서 IL-17A 분비를 감소 시켰다. 또한 염증성 사이토카인으로 자극한 HaCaT 피부 각질세포주에 PG102 처리 시 CXCL1, IL-8, S100A8/9, hBD-2 등의 키모카인 및 항균펩타이드들의 발현을 RNA 및 단백질 수준에서 감소 시켰다. 이러한 효과는 NF-kB 및 STAT 신호전달경로를 조절함으로써 작용하는 것을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰했다. 이 인자들은 건선 증상을 악화시키고 호중구 화학주성 (chemotaxis)을 유도한다고 알려져 있는데 migration assay를 통해 PG102가 in vitro에서 호중구 세포주의 이동을 억제하고 마우스 건선 모델에서 피부로 침투한 호중구 세포의 수를 유의미하게 감소 시키는 현상을 관찰했다. 이 결과들은 PG102가 호중구 세포의 침투를 억제 시킴으로써 건선 완화 효과를 나타낼 수 있다는 것을 의미한다.

다음으로 항염증 사이토카인 IL-37이 각질세포에서 하는 역할과 PG102가 이의 발현에 미치는 영향을 밝히는 연구를 수행하였다. HaCaT 세포에서 siRNA를 이용해 IL-37를 억제한 후 사이토카인으로 자극 시 항균펩타이드의 발현이 대조군에 비해 유의미하게 증가함을 발견했다. 이는 각질세포에서 IL-37을 증가 시키는 것이 건선 완화에 도움을 줄 수 있음을 시사한다. 본 연구에서는 PG102가 HaCaT 세포에서 IL-37 발현을 RNA 및 단백질 수준에서 유의미하게 증가시킴을 관찰했다. PG102 처리 시 ERK, p38 MAPK와 Smad3의 인산화가 농도의존적으로 증가했다.반면 이 kinase 들의 억제제를 처리하면 IL-37 발현이 증가하지 않는 것을 관찰했다. 이는 PG102가 ERK, p38 MAPK 및 Smad3 신호전달경로 활성화를 통해 IL-37의 발현을 조절한다는 사실을 의미한다. 또한 IL-37은 phospho-Smad3와 결합하여 항염증 효과를 나타내는데 PG102는 이 둘의 결합을 촉진했다. 이 결과들은 PG102의 효과가 IL-37의 발현 및 기능을 조절함으로써 작용할 수 있다는 것을 의미한다.

마지막으로 PG102의 항건선 활성을 가진 물질, 또는 분획물을 분리하기 위해 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 이용해 PG102를 분획했다. 이후 각 분획물의 활성을 이미퀴모드로 유도한 마우스 건선 모델 및 HaCaT 세포에서 관찰했다. 그 결과 PG102의 총 활성은 어느 한 분획물로도 농축되지 않고 각 분획으로 분리 되었다. 그 중 에틸아세테이트 분획물은 상대적으로 높은 향균펩타이드 발현 억제능을 보였고 물 분획물은 상대적으로 높은 키모카인 발현 억제능을 HaCaT 세포에서 보였다. 하지만 각 분획물들은 동일한 농도에서 PG102 보다 낮은 활성을 보였다. 이는 각 분획물들에서 항건선 활성을 가진 특정 성분들이 복합적으로 작용하여 PG102의 전체적인 효과를 나타낼 가능성을 시사한다.

이 연구를 통해 PG102의 국소도포는 마우스 건선모델에서 치료효과를 나타낸다는 것을 밝혔다. PG102는 직접적으로 다양한 염증성 인자, 신호전달경로 및 호중구의 침투를 조절을 막고 항염증 사이토카인의 발현을 증가 시킴으로써 간접적으로 각질세포의 염증 반응을 조절한다는 것을 관찰했다. 선행 및 본 논문 연구의 결과들을 종합해 볼 때, PG102는 다양한 염증성 피부질환들에 안전하고 효율적인 치료제로 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.

PG102 is a water-soluble extract from Actinidia arguta, commonly known as a hardy kiwifruit. It has previously shown to contain potent anti-inflammatory and anti-oxidative activities both in vitro and in vivo. Based on previous works done in our laboratory, it was hypothesized that it might possess ameliorating effects on psoriasis. In particular, my thesis research was focused on anti-inflammatory effects of PG102 on psoriasis-like skin inflammation in the mouse model and human keratinocyte cell line, HaCaT. I also attempted to identify fraction containing related biological activities.

First, the effects of PG102 on imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation model were tested. Topical application of PG102 suppressed increase in epidermal thickness and IL-17A levels in draining lymph node and serum. In HaCaT keratinocyte cell line, PG102 was found to downregulate expressions of various neutrophil-chemotactic chemokines and antimicrobial peptides such as CXCL1, IL-8, S100A8/9 and hBD-2 when cells were stimulated with mixture of five inflammatory cytokines. These effects were mediated by inhibition of NF-kB and STAT signaling pathway as evidenced by data from Western blot. The effects of PG102 on neutrophil chemotaxis were further investigated using migration assay and immunohistochemistry. The results indicated that PG102 might ameliorate symptoms of psoriasis via suppression neutrophil chemotaxis.

Interleukin 37 (IL-37) is an immunomodulatory cytokine that suppresses inflammation in various cell types and disease models. Another detailed biological investigation was carried out to study the effect of PG102 on IL-37, a potent anti-inflammatory cytokine, in HaCaT cells. In HaCaT cells, siRNA-mediated knockdown of IL-37 significantly augmented expression of antimicrobial peptides when the cells were exposed to inflammatory cytokines. These results indicated that upregulation of IL-37 might be a potential approach to alleviate psoriasis. It was found that treatment with PG102 effectively increased expression of IL-37 at both RNA and protein levels and these effects were mediated by activating ERK, p38 and Smad3 pathways. PG102 also promoted colocalization of phospho-Smad3 and IL-37 which is necessary for the anti-inflammatory effects of IL-37. These results suggested that PG102 might exert anti-inflammatory effects, in part, through modulation of IL-37.

Lastly, I tried to identify compounds or fractions responsible for anti-psoriatic effects of PG102. PG102 extracts were fractionated using chloroform, ethyl acetate, butanol and water. Each fraction was tested for its effects in psoriasis-like skin inflammation model and HaCaT cells. It was found that the holistic bioactivity of PG102 was distributed into each fraction, without much specificity. Among four fractions, ethyl acetate fraction possessed stronger antimicrobial peptide-suppressing activities, whereas water fraction possessed higher chemokine-suppressing activities than other two fractions in vitro. However, none of the fractions were more effective than total PG102 in terms of anti-psoriatic effects. These results demonstrated that the combinatorial effects of different fractions of PG102 might lead to the bioactivity of PG102 observed in mouse psoriasis-like skin inflammation model and M5-stimulated HaCaT cells.

In conclusion, PG102 showed therapeutic effects on imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation model. These effects might be mediated directly by suppressing inflammatory signaling cascades NF-κB, STAT signaling pathways and neutrophil chemotaxis and indirectly by upregulating anti-inflammatory cytokine IL-37 in keratinocytes. The anti-psoriatic effects of total PG102 was the strongest and none of the fractions showed dominant bioactivities. Taken together with previous findings, PG102 may be developed as a safe and effective agent for the treatment of various inflammatory skin diseases.