에리스리톨 생산의 증대를 위한 Candida magnoliae 균주의 발효조건 최적화 및 유전공학적 연구

Abstract

Erythritol is a four-carbon poly-hydric alcohol (C4H10O4) that exists naturally in a wide variety of foods including mushroom, watermelon, pear and grape. As an emerging alternative sweetener, erythritol possesses 70~80 % sweetness of sugar and only 10% of the ingested erythritol is metabolized. It also features a strong cooling effect and prevents dental carries. Candida magnoliae isolated from honeycomb is an osmophilic yeast able to produce erythritol. The osmophilic mutant of C. magnoliae (C. magnoliae SR101) was generated by UV mutagenesis and EMS (Ethyl methanesulfonate) treatment and performed higher erythritol productivity and yield than the parental strain. Since the composition of growth medium is a crucial factor for erythritol production, optimizing the medium components was undertaken for C. magnoliae SR101. In addition, genetic engineering was applied for improved erythritol production. First, the effects of medium components were evaluated. Elimination of MgSO4 from the fermentation medium resulted in a 39% increase in erytrhritol productivity and a 38% increase in erythritol yield. It seems that the presence of magnesium ion in the fermentation medium negatively affected erythritol production of C. magnoliae SR101 and moreover, glycerol was produced during fermentation, which was not formed when magnesium ion was eliminated from the medium. Second, additional components such as manganese and thiamine were supplemented to the fermentation medium to improve the erythritol production. Addition of 1 mg/L MnSO4•H2O which is known to increase the permeability of a cell increased erythritol productivity by 6% and yield by 9%. Alteration in cell permeability was confirmed by measuring the intracellular erythritol concentration. The intracellular erythritol decreased from 0.02 g/L•DCW to 0.007 g/L•DCW when manganese ion was added. Addition of 5 mg/L of thiamine to the fermentation medium resulted in a 15% increase in productivity and 18% increase in yield. Addition of thiamine increased not only erythritol production, but also cell growth and glucose consumption. It is reported that thiamine enhances the activity of transketolase (TK) which is known as an important enzyme for erythritol production. To characterize the thiamine addition effects at a protein level, changes in TK activity by thiamine should be measured. Third, overexpression of the erythrose reductase (ER) gene was attempted to improve the erythritol producing ability of the C. magnoliae SR101 strian. ER is known to be a key enzyme for erythritol production. In order to integrate the ER gene, two different approaches were made. UV mutagenesis was used to generate an ura3- auxotrophic mutant. However, although the ura- strains were generated, the URA3 region was found to be unchanged according to the sequencing results. Additional UV mutation should be performed to select the ura3- strain. Another approach was using aureobacidinA as a selection pressure after transforming the ER gene into C. magnoliae SR101. Homologous recombination with the URA3 gene did not occur although the linearized DNA was introduced into the cell. The homologous recombination in C. magnoliae SR101 should be redesigned by taking into account other candidate genes for ER integration.

에리스리톨은 4탄당의 알코올(C4H10O4)로서 버섯, 수박, 배, 포도 등 다양한 식품 내에 존재한다. 에리스리톨은 설탕의 70~80%의 당도를 가지며 체내에서는 거의 대사되지 않아 설탕의 대체 감미료로서 주목 받고 있다. 또한 섭취 시 입안에 청량감을 주며 충치를 유발하지 않는다는 장점이 있다. 소비(벌집)로부터 분리된 Candida magnoliae는 내삼투성 효모로서 에리스리톨을 생산하는 균주이다. C. magnoliae SR101은 돌연변이 균주로서 더욱 향상된 에리스리톨 생산능을 갖는다. 배지의 조성은 에리스리톨을 생산하는데 있어 매우 중요한 요소이기 때문에 이를 최적화 시키고자 하는 연구가 진행되었다. 추가적으로 에리스리톨 생산균주를 개량하기 위해 유전 공학적 기법을 도입하고자 하였다. 우선 기존에 사용하던 배지의 성분들의 에리스리톨 발효에 대한 영향을 검토해 보았다. 배지로부터 MgSO4를 제거 하였을 때, 오히려 에리스리톨 생산성은 39%, 수율은 38%가 증가함을 확인하였다. 마그네슘이 배지상에 존재 할 때 C. magnoliae SR101의 에리스리톨 생산에 부정적인 영향을 미쳤으며 또한 글리세롤이 추가로 생성됨을 확인하였다. 이후 마그네슘을 제거하고 추가적으로 다른 금속이온 및 thiamine, inositol, phytic acid를 첨가하여 에리스리톨 생산에 대한 영향을 분석하였다. 세포의 투과성을 증가시킨다고 알려진 망간이온을 1mg/L의 농도로 배지에 첨가시켰을 때, 에리스리톨의 생산성과 수율은 각각 6%, 9%씩 증가하였다. 세포 투과성의 변화는 세포 내 에리스리톨의 양을 측정함으로써 확인하였다. 결과적으로 망간이온을 첨가하였을 때 세포의 투과성이 증가하여 세포내의 에리스리톨 양이 감소하는 것을 알 수 있었다. 5 mg/L의 Thiamine 첨가 시에는 생산성은 15%, 수율은 15%가 증가함을 알 수 있었다. Thiamine은 세포 내에서 thiamine pyrophosphate로 전환되어 에리스리톨 생산 경로에 관여하는 transketolase의 활성을 증가시켜 에리스리톨 생산을 향상시킨다고 보고되어 있는데 이후 연구에서 thiamine첨가에 의한 transketolase활성의 변화를 측정할 필요가 있다. 결론적으로, 기존의 에리스리톨 배지로부터 마그네슘을 제거하고 thiamine을 첨가하였을 때, 에리스리톨 생산이 가장 뛰어난 것을 확인하였다. 발효조건의 최적화 연구와 더불어 C. magnoliae SR101균주를 유전공학적 기법을 이용하여 개량하는 연구도 수행하였다. 에리스리톨 생산에 있어 주요 효소로 알려진 erythrose reductase(ER) 유전자를 C. magnoliae SR101 안으로 도입시키기 위해 두 가지 방법을 사용하였다. 첫째, ura3- 영양요구성 균주를 만들기 위해 자외선 조사를 실시하였다. 그 결과 ura- 균주는 선별을 하였지만, 서열분석 결과 URA3 위치가 변이된 것은 얻지 못하였다. ura3- 균주를 선별하기 위해서는 추가적인 자외선 조사과정이 필요할 것으로 보인다. 둘째, 항생제의 하나인 aureobacidinA를 형질전환의 선별 도구로 사용하였다. 결과적으로 ER이 포함된 DNA는 세포 내로 도입이 되었지만, 세포 내에서 상동 재조합이 일어나지 않아서 ER이 염색체 안으로 통합되지는 않은 것으로 보인다. 이에 따라 C. magnoliae SR101 내에서의 상동 재조합 방법을 재 설계하고 ER을 통합시킬 수 있는 다른 후보 유전자를 선별해야 할 것으로 사료된다.