A proteomic approach for concurrent identification of O-GlcNAcylated and phosphorylated proteins via TiO2 affinity separation and BEMAD derivatization

Abstract

Posttranslational modifications (PTMs) of serine and threonine residues of nuclear and cytoplasmic proteins by either O-GlNAcylation (O-linked -N-acetyl glucosaminylation) or phosphorylation are ubiquitous and transitory processes. The interplay between the O-GlcNAcylation and phosphorylation has been reported to be highly dynamic and involved in numerous cellular processes, such as nuclear transport, transcription and translation, cytoskeletal reorganizations, proteosomal degradation, and apoptosis. Thus, methods for concurrent identification and quantification of O-GlcNAcylated and phosphorylated proteins are needed for the study two PTM dynamic changes associated with pathological states including diabetes, Alzheimers disease and cancer. Until recently, many technical methods have been developed for site modifications of O-GlcNAcylated proteins in variety ways such as enzymatic labeling, lectin affinity chromatography and chemical derivatization. Despite such technical advances for O-GlcNAcylated and phosphorylated site-mapping methods are needed to understand valuable insights for the regulation of cellular processes by the PTMs. Here we describe a method selective isolation, concurrent identification and quantification of O-GlcNAcylated and phosphorylated proteins. It is based on the separation of O-GlcNAcylated and phosphorylated peptides using a TiO2 micro-spin affinity column, removing O-GlcNAc and phosphate groups by -elimination, conjugation with normal DTT (d0-DTT) or isotopically labeled DTT (d6-DTT) and isolation of DTT-conjugated peptides by a thiol column chromatography. The isolated peptides are then identified and quantified by mass spectrometry. This newly developed method allows us to investigate the concurrent transitory posttranslational modifications events between O-GlcNAcylation and phosphorylation. Furthermore, with this method, we may be able to elucidate the underlying mechanism of specific roles of O-GlcNAcylation and phosphorylation of proteins in the pathogenesis of various human diseases such as diabetes, Alzheimers disease and cancer.

핵과 세포질 단백질의 세린(serine)과 트레오닌(threonine)잔기에 일어나는 전사 후 변형 과정 (post-translational modification, PTM)인 인산화(phosphorylation)와 O-GlcNAcylation은 흔히 볼 수 있는 일시적인 과정이다. 이러한 인산화와 O-GlcNAcylation의 상호작용은 매우 역동적이며, 핵내로의 물질수송과, 유전자의 전사, 전이, 세포 내 골격의 재조직화, 단백질 가수분해, 세포사멸 등과 같은 다양한 세포내 과정에 관련 되어있다. 따라서 O-GlcNAcylation된 단백질과 인산화된 단백질에 대한 동정과 정량을 동시에 시행하는 본 실험 방법은 이 두 PTM의 역동적 변화와 관련된 당뇨, 치매 그리고 암과 같은 질병 연구에 도움이 될 것이다. 지금까지 O-GlcNAcylation이 일어나는 수식화 위치를 규명하기 위해 enzymatic labeling, lectin affinity chromatography and chemical derivatization 등과 같은 다양한 기술적인 방법들이 시도되었다. 이러한 기술적 진보에도 불구하고 PTM에 의한 세포 내 조절과정을 깊이 있게 이해하기 위해서는 이에 적합한 방법이 필요하다. 이에 본 논문에서는 인산화와 O-GlcNAcylation을 포함하고 있는 펩타이드(peptides)를 선택적으로 분리하여, 동정과 동시에 상대적인 정량을 할 수 있는 방법을 연구하였다. 이 방법은 TiO2 micro-spin affinity column을 이용하여 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 분리한 후, -elimination을 통해 세린 또는 트레오닌 잔기에 수식화 되어 있는 인산기와 O-GlcNAc을 제거하고 그 자리에 서로 다른 질량 값을 가지는 DTT (d0 / d6)를 부가시킴으로써 thiol column을 이용하여 thiol기가 존재하는 펩타이드, 즉 인산화와 O-GlcNAc 펩타이드들 만을 정제하는 방법이다. 이렇게 정제된 펩타이들은 질량 분석기를 통해 분석이 된다. 본 연구에서 고안한 새로운 방법은 인산화와 O-GlcNAcylation 상호간에 발생하는 일시적이며 동시적인 PTM 연구를 가능하게 하여, 당뇨와 알츠하이머, 암을 비롯한 다양한 질병과 연관되어 있는 단백질들의 인산화와 O-GlcNAcylation의 특이적인 기능과 그 기작 을 밝히고 이해하는데 도움을 줄 것이다.