Functional characterization of cytochrome P450 1A1 Ala62Pro allelic variant

Abstract

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) is a member of CYP1 family, which is expressed mainly extrahepatically in humans and plays important roles in the bioactivation of procarcinogenic xenobiotics. The human CYP1A1 gene is polymorphic and several SNPs have been reported and studied. The novel G184C polymorphism of CYP1A1 resulting in Ala62Pro (A62P) substitution was first identified in Korean population and observed to be associated with an increased risk of lung cancer. In this study, the functional significance of the A62P substitution in CYP1A1 was examined by expression of recombinant CYP1A1 wild-type (WT) and A62P in E. coli cells. Transcriptional and translational efficiency of CYP1A1 apoenzyme were not affected by A62P substitution, and the anchoring of CYP protein to the E. coli cytosolic membrane was not impaired. However, the A62P variant showed significantly decreased level of the holoenzyme in E. coli spheroplast and membrane fraction, indicating that most of the CYP1A1 A62P enzymes were nonfunctional apoenzymes without heme. CYP1A1 A62P enzymes in membrane fraction were also less soluble to CHAPSdetergent than WT enzymes. However, there was no significant difference between ethoxyresorufin-O-deethylation activities of purified recombinant CYP1A1 WT and A62P holoenzymes. This result demonstrates that A62P mutation causes functional alteration of CYP1A1, possibly being involved in protein folding and heme incorporation, though it is not expected to affect the regions directly related to the catalytic activity.

Cytochrome P450 1족 (family)에 속하는 CYP1A1은 주로 간외조직에서 발현되며, 발암전구물질의 생체활성과정에 있어 매우 중요한 역할을 한다. 인간 CYP1A1 유전자는 다형성을 나타내며, 몇몇 개의 단일염기서열다형성이 보고, 연구 되었다. 한국인에서 최초로 밝혀진 CYP1A1 유전자의 G184C 단일염기서열다형성은 62번째 아미노산 잔기를 Alanine에서 Proline으로 변이시키며, 폐암 위험도의 증가와 관련이 있는 것으로 보고되었다. 본 연구는 대장균에서 CYP1A1 재조합 단백질을 발현하여 Ala62Pro 변이로 인한 CYP1A1 단백질의 기능적 변화를 규명하였다. Ala62Pro 변이는 대장균 세포 내에서의 CYP1A1 아포효소 (apoenzyme)의 전사, 번역 효율에 영향을 주지 않았으며, 대장균 세포막에 CYP1A1 단백질이 결합되는 정도에도 영향을 주지 않았다. 그러나 Ala62Pro 변이형 CYP 완전효소(holoeznyme)의 양은 야생형 (wild -type) 비해 낮은 것으로 나타났는데, 이것은 대부분의 CYP1A1 A62P 변이형 단백질이 heme기가 결여된 무기능 단백질 형태로 존재한다는 것을 시사한다. 하지만, 제 기능이 유지된 완전효소 양을 기준으로 하여 CYP1A1 야생형 단백질과 Ala62Pro 변이 단백질의 7-에톡시레소루핀-O-디에틸라아제 (EROD) 활성을 비교할 경우, 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 Ala62Pro 변이가 효소 활성과 관련된 부위에 직접적인 영향을 주지는 않지만, CYP 단백질의 heme기의 유입에 영향을 줌으로써, 기능 변화를 유발한다는 것을 시사한다.