Functional relevance of nitrated tyrosine residues at Y250 and Y360 in rOAT2

Abstract

이전 연구에서, rOAT3(rat organic anion transporter 3) 의 기능적으로 중요한 세 가지 위치의 tyrosine 이 존재함을 보고한 바 있다. 또한 본 연구실에서는 유사한 연구를 통해 사람의 analog 에 대해서도 nitration 에 의한 유사한 기능적 변화를 파악하였다. 그런데 hOAT3 를 포함한 organic anion transporter 들은 일반적으로 두 가지의 conserved tyrosine 이 존재하는데, rOAT2(rat organic anion transporter 2) 역시 그 두 종류의 tyrosine 이 250, 360 위치에 존재함이 알려졌다. 따라서 본 연구의 목적은 rOAT2 를 OAT 의 모델 수송체로 상정하고 250, 360 위치의 nitrated tyrosine 과 transporter 의 기능적 연관성을 알아보고, nitration 에 의한 transporter 의 기능적인 변화를 알아보는 것이다. rOAT2 를 reference sequence 에 맞춰 cloning 한 후, 일련의 과정을 거쳐 MDCKII/FRT cells 에 발현시켰다. 그리고 250, 360 위치에 존재하는 tyrosine(Y250, Y360) 을 site-mutagenesis 를 이용하여 phenylalanine 으로 치환한 mutants 를 각각 만들고, 역시 cell 에 발현시켰다. 그 후 기질로서 radiolabelled 된 salicylate 를 이용하여 각각의 기능 변화를 확인하였다. 그 결과 Y250F 는 normal rOAT2 와 비교했을 때 기능의 변화가 거의 나타나지 않았으나, Y360F 은 기능적 감소를 보였다. 또한 normal rOAT2 와 두 가지의 mutants 에 NOx donor 를 전처리 했을 때, 모두 기능적 감소를 보였다. 결과적으로 Y360 이 Y250 보다 rOAT2 의 기능에 더 중요한 역할을 하며 이러한 기능의 감소는 tyrosine 의 nitration 과 관련이 있다고 볼 수 있다. 따라서 이 결과는 임상적으로 nitrosative stress 상태에서의 여러 유기음이온 수송계의 기능이 변화되었을 것으로 추정된다.