UPLC/ Q-TOF MS를 이용한 20(S)-ginsenoside Rg3와 TRAIL을 처리한 세포주의 대사체 연구

Abstract

항암 치료법에는 수술, 방사능 요법, 화학요법 등이 있다. 치료 방법 중 화학요법이 잘 쓰이고 있지만 항암제는 독성이 강하며 경우에 따라 발암제로도 적용할 수 있고 부작용이 매우 크다. 때문에 최근 항암 효과를 높이고 부작용을 경감시키기 위한 병용투여요법 관련 연구가 많이 진행되고 있다. 본 연구에서는 간암세포인 HepG2 cell에 항암제로 쓰이는 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)과 20(S)-ginsenoside Rg3를 각각 처리 했을 때와 병용 처리하였을 때의 항암효과를 MTT assay를 통해 비교하였다. control, Rg3, TRAIL 단독 처리 그룹에서는 약 90%의 암세포 생존율을 보였지만, Rg3와 TRAIL을 병용 처리했을 때 약 30%의 암세포 생존율을 보였다. 이 결과, Rg3와 TRAIL의 항암 활성 상승 효과를 입증하였다. 또한 두 약물을 병용 처리 했을 때 나타나는 항암 활성 상승 효과 에 관한 기전을 밝히기 위하여 대사체학 접근 방법을 이용하여 연구하였다. control과 Rg3, TRAIL 단독 처리, Rg3와 TRAIL을 병용 처리한 (n=5) HepG2 cell 내 대사체를 추출한 뒤, UPLC Q-TOF MS로 분석 하고 다변량 통계분석을 이용하여 집단간 판별분석을 시행하였다. 그 결과, OPLS-DA에서 Rg3와 TRAIL을 병합하여 처리한 그룹과 그렇지 않은 그룹으로 나뉘어졌다. 그 후, ANOVA를 이용하여 통계적 차이가 나는 UPLC/Q TOF-MS region을 비교하고 HMDB와 같은 database를 통해 20(S)-ginsenoside Rg3와 TRAIL을 병용 처리한 그룹과 그렇지 않은 그룹 간의 차이가 나는 물질을 MS/MS를 통하여 동정하였다. 그 결과, cytokine-induced apoptosis를 통한 항암활성과 관련되어 있는 Oxidized glutathione 임을 알 수 있었다. 이 연구 결과를 통해, TRAIL과 20(S)-ginsenoside Rg3를 병용처리 시, 적은 투여량에도 큰 항암효과를 나타나는 것을 확인 하였으며, 이러한 synergy effect를 대사체학 접근방법을 이용해 약물을 처리한 집단을 구별하는 marker를 찾았다. 그리고 이 marker가 cell signal pathway상에서 어떤 관련이 있는지를 추론하고 메커니즘을 밝힐 수 있는 기반을 마련하였다.

20(S)-ginsenoside Rg3, a marker compound of Red ginseng, is considered to possess a number of biological functions including anti-cancer activities. And TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) has been identified as a member of the TNF family that induces apoptosis in a variety of tumor cells, but its physiological functions are largely unknown. In this study, metabolomic technique was employed to evaluate the mechanism of 20(S)-ginsenoside Rg3 and TRAIL of anti-cancer activities using HepG2 cells, human liver cancer cell line, by Ultraperformance liquid chromatography coupled with Q-TOF mass spectrometry (UPLC Q-TOF MS). UPLC Q-TOF MS spectra of cell extracts compared with those of 20(S)-ginsenoside Rg3 treated cell extracts gave bio marker candidates with statistical analysis using SIMCA-P and R. As a result, eleven biomarker candidates found and assumed to be involved metabolism of HepG2 cells. Overall, I Developed a reliable discrimination method between 20(S)-ginsenoside Rg3 and TRAIL treated cells using UPLC Q-TOF MS based metabolomic technology and selected the marker candidates for discrimination by the statistical analysis. Then, I confirmed the synergistic effects of Rg3 and TRAIL in metabolomic level and identifying the possibilities of clinical applications.