Chondrogenic differentiation potential of parthenogenetic murine embryonic stem cells is promoted by three dimensional cell differentiation system

Abstract

Embryonic stem cells (ESCs) have pluripotency and potential to differentiate into all types of somatic cells. Generation of cartilaginous tissues using pluripotent stem cells can be one of the solutions for cartilage regeneration and skeletal tissue repair as the mass production of cartilaginous cells is required for the cure of cartilaginous defects and diseases. Parthenogenetic ESCs (PESCs) can be a useful stem cell source for tissue regeneration. The defect in full-term development of PESCs enables researchers to avoid the ethical concerns related with ESC research as well. Moreover, PESCs have the patient's own genetic information if the cells are originated from the oocytes of the same patient.

In this study, we presented the results demonstrating that PESCs can differentiate into chondrogenic cells by the induction medium containing multiple induction factors such as retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, bone morphogenetic protein-2 (Bmp-2), and transforming growth factor - beta (Tgf-β). In the first step, floating aggregates called embryoid bodies (EBs) were formed from the murine PESCs in the medium containing serum and retinoic acid for the 5 days of culture. In the second step, the EBs were transferred to modified induction medium in the 6-well culture plates with serum, ascorbic acid, dexamethasone, Bmp-2, and Tgf-β supplements, and then cultured for additional 21 days in two or three dimensional culture environments without passaging the cells. After the induction, gene expressions of specific chondrogenic markers, such as Chordin-like 1, Collagen-2, Aggrecan, Decorin, MMP13 and Pax-1, were analyzed by real time PCR. The cells from all experimental groups showed the morphology of murine chondrocytes after chondrogenic induction and this was confirmed by Alcian blue staining. Moreover, the cells cultured by the 3D culture method showed the highest differentiation efficiency. The expression levels of all four genes except Decorin and MMP13 were 4~14 fold higher in the 3D culture system than the 2D counterpart.

The results demonstrate that the 3D culture system can be used to improve the efficiency of chondrogenic differentiation from the murine PESCs. This may contribute to the study of chondrogenesis and cartilaginous tissue repair.

연골은 무혈관 조직으로 손상을 받거나 증령과 관련된 퇴행성 질환이 발생 시, 손상부에 전구세포 및 줄기세포의 유입이 잘 되지 않아 회복이 어려운 특징을 가지고 있다. 이는 노인의 무릎 관절에서 흔히 발생하는 퇴행성 골관절염 및 치과영역과 관련되어서는 측두하악관절에서 발생하는 퇴행성 관절염 등에 있어서 그 치료가 어려운 이유 중 하나이다. 배아줄기세포는 다능성을 가지고 있는 세포로 모든 종류의 체세포로 분화 가능한 특징을 가지고 있다. 이러한 다능성을 가진 줄기세포를 사용해 연골조직의 발생을 유도하는 것은 손상 받은 연골조직을 재생시킬 수 있는 한 가지 방법이 될 수 있는데, 이는 대부분의 연골 결함 및 질환을 치료하기 위해서는 다량의 연골세포가 생성되어야하기 때문이다. 단위발생배아줄기세포는 조직 재생을 위해 유용하게 사용될 수 있는데, 특히 이 세포들은 완전한 개체로 발생이 완료되지 않기 때문에 연구자들로 하여금 일반적인 배아줄기세포를 사용한 실험에서 만나는 윤리적인 논란 을 피할 수 있게 해준다. 또한 단위발생줄기세포는 환자 본인의 난자로부터 세포가 기원하는 경우에는 자신의 유전정보를 완전히 동일하게 가지고 있는 세포를 사용할 수 있어 이로부터 발생된 조직을 추후에 이식하는 치료 등을 시행함에 있어 발생할 수 있는 면역거부반응 또한 회피할 수 있는 장점이 있다. 따라서 단위발생배아줄기세포를 사용해 연골조직의 발생을 효율적으로 유도할 수 있다면, 이는 연구윤리에 문제됨이 없이 퇴행성 연골질환과 같은 인류의 질병을 치료하는데 기여할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 연골분화를 유도하는 다양한 인자들을 포함하는 배지에서 단위발생줄기세포를 배양해보았다. 기존에 많이 사용되었던 2차원적인 배양방법을 사용하는 동시에 alginate bead를 통한 3차원 배양을 도입해 두 가지 시스템의 연골분화 유도능을 비교해보았다. 연골세포로의 분화정도는 기존에 알려진 연골조직에 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도를 Real time PCR을 사용해 측정했고, Alcian blue 염색법을 통해 연골조직에 존재하는 glycosaminoglycan을 염색하는 방식으로 연골조직으로의 분화를 확인할 수 있었다. 결과적으로 2차원 배양방식에서보다 3차원 배양방식을 도입했을 때, 연골조직관련 유전자가 더 많이 발현됨을 확인할 수 있었다. 이는 3차원 배양방법을 통해 단위발생줄기세포를 더 효율적으로 연골세포로 분화시킬 수 있다는 사실을 보여주며, 이를 발전시켜 손상된 연골조직의 세포치료에 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 시사한다.