The Effect of Valproic Acid on Proliferation and Differentiation of Human Periodontal Ligament Stem Cells

Abstract

Purpose Human periodontal ligament stem cells (PDLSCs) are a kind of mesenchymal stem cells (MSCs) originated from dental tissues. They can be easily obtained from discarded dental biological wastes (extracted third molars) and differentiated into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Valproic acid (VPA) is a fatty acid with simple branched-chain. It has been used as a wide spectrum antiepileptic drug or medication for mood disorders. Recently, many new discoveries about VPA have emerged in the view of cancer treatment. The effect of VPA on cancer cells have been known to inhibit proliferation and induce differentiation and apoptosis. In contrast to these reports, it is supposed that VPA inhibits differentiation and enhances proliferation in hematopoietic stem cells, to increase the pluripotency of embryonic stem cells and to enhance osteodifferentiation and the migration of MSCs. However, it is unknown whether the effects of VPA are inhibitory or enhancing on proliferation and differentiation of human PDLSCs. To address this question, we have used several different concentrations of VPA on PDLSCs during proliferation and differentiation.

Materials & Methods Human PDLSCs were collected from the impacted third molars of normal human and treated with culture medium containing 0, 0.5, 1, and 5mM VPA for 24 hrs. Then normal culture medium without VPA was used for the next 48 hrs after washing with 1X PBS. This is one cycle of VPA treatment, and the cycle was repeated three times consecutively. Immunocyto-chemistry was used to detect MSCs marker gene, STRO-1. Meanwhile, direct cell counting, MTT assay, and BrdU assay were used to evaluate the cellular proliferation of PDLSCs. To determine apoptosis, fluorescent activated cell sorter was used for flow cytometry, then PDLSCs were cultured in cemento/osteogenic or adipogenic differentiation medium to evaluate the effect of VPA on the differentiation. Extracellular calcium accumulation was estimated by alizarin red S solution. Lipid droplet accumulation was estimated by oil red O solution. RT-PCR was conducted to detect expression of various genetic markers (GAPDH, CXCR4, ALP, OCN, OPN, Col I, RUNX2, PPARγ2, LPL).

Results In higher concentration of VPA (5mM), the cellular shrinkage and shortening of cellular process were identified, but not discovered in 0.5mM and 1mM of VPA. All groups showed positively stained PDLSCs for STRO-1. After repetitive treatment of VPA, decrease in cell proliferation was observed in 1mM and 5mM VPA treatment groups. Tendency of increase in cell proliferation was detected in 0.5mM VPA group after the 3rd cycle. In BrdU assay, there was no significant difference among these three groups after 24 hrs VPA treatment. However, we observed the increase of proliferation rate in 0.5mM VPA group after 48 hrs VPA treatment. Apoptosis decreased in 0.5mM VPA group, compared to the control group. In the cemento/osteogenic differentiation, there was significant decrease of absorbance rates of alizarin red S in VPA treatment groups. The expression of osteogenic differentiation markers decreased along with the treatment of VPA. VPA also inhibited adipogenic differentiation of PDLSCs. The expression of CXCR4 increased with VPA concentration increase in both proliferation and cemento/osteogenic differentiation.

Conclusion The cyclic treatment of 0.5mM VPA concentration seemed to induce cell proliferation and attenuate apoptosis without definite cellular morphological change. But, higher concentration of VPA, such as 1 and 5mM, suppressed cellular proliferation and promoted apoptosis. VPA inhibited the cemento/osteogenic and adipogenic differentiations of PLDSCs. CXCR4 mRNA expression was increased along the VPA treatment.

연구 목적 사람 유래 치주인대 줄기세포는 간엽성 줄기세포의 하나로서, 채취가 비교적 간단하고 골모세포나 연골세포, 지방세포로의 분화능이 알려져 있어 재생 치의학 분야에서 활발히 연구되고 있다. 발프로산은 단순지쇄지방산의 구조를 띄고 있으며 광범위 항간질제나 기분장애 치료제로 장기간 유용하게 사용되어온 제재이다. 최근에는 이러한 신경정신과적인 치료범주 외에도 항암제로서의 효능에 대한 연구가 진행중이며, 암세포와 관련된 많은 연구에서 암세포의 성장을 억제하고 분화와 자연세포소멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 반면 조혈줄기세포에 처리시 분화를 억제하고 성장을 촉진시키며, 배아줄기세포의 다능성을 증가시킨다는 보고가 있다. 또한, 간엽성 줄기세포의 골분화와 이동을 촉진한다고 알려져 있다. 하지만 발프로산이 치주인대 줄기세포에 미치는 영향에 대해서는 그 연구가 미비한 실정이므로, 본 연구에서는 발프로산이 치주인대 줄기세포에 미치는 영향에 대해 살펴보고자 한다.

연구 대상 및 방법 사람의 제 3 대구치에서 채취한 치주인대 줄기세포에 여러 농도 (0, 0.5, 1, 5mM) 의 발프로산을 24시간 처리하고 제거한 뒤 48시간 동안 정상배지에서 배양하는 과정을 최대 3회까지 반복하였다. 우선 면역세포화학 염색법으로 치주인대 유래세포의 간엽성 줄기세포 여부를 평가하였다. 그리고 발프로산이 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해, 직접 계수법에 의한 세포수 측정, 비색법 및 핵산표지에 의한 세포증식 판정(MTT assay, BrdU assay)을 시행하였고, 형광활성 생물세포 분류장치를 이용한 자연세포소멸 정도를 평가하였다. 발프로산이 세포분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 발프로산이 포함된 백악모세포/골모세포 분화 및 지방세포 분화배지에 세포를 배양하였다. 백악모세포/골모세포 분화군에서는 alizarin red S 염색을 이용한 세포외 칼슘 축적량과 알칼리성 인산가수분해효소의 활성을 측정하였다. 지방세포 분화군에서는 oil red O 염색을 통해 지방 액적량을 측정하였다. 역전사 중합효소연쇄반응을 통해 다양한 유전자의 발현정도를 확인하였다(GAPDH, CXCR4, ALP, OCN, OPN, Col I, RUNX2, PPARγ2, LPL).

결과 고농도인 5mM 농도의 발프로산에 처리한 경우 세포가 위축되고 세포돌기가 짧아지는 경향을 볼 수 있었으나, 저농도로 처리한 0.5, 1mM 농도의 경우 세포의 형태에 큰 변화는 관찰되지 않았다. 모든 군에서 간엽성 줄기세포의 표시자인 STRO-1에 양성의 염색 반응을 보였다. 직접계수법에 의한 세포수 측정 및 MTT assay 에서, 발프로산의 반복적 처치시 1mM 과 5mM 농도군의 경우 세포증식이 감소하였으나, 0.5mM 농도군의 경우 세포증식의 증가경향이 관찰되었다. BrdU assay 에서는 발프로산을 24시간동안 처치한 직후의 경우, 서로 다른 농도군간에 큰 차이는 보이지 않았다. 반면에, 발프로산을 48시간동안 지속적으로 처치하였을때, 0.5mM 농도군에서 대조군에 비해 세포증식능의 유의미한 증가가 관찰되었다. 자연세포소멸 평가결과, 0.5mM 농도군에서 자연세포소멸이 감소하였다. 백악모세포/골모세포 분화유도후 시행한 alizarin red S 흡광도 측정시 발프로산 처치군에서 대조군에 비해 유의한 감소가 관찰되었고, 골분화 관련 유전자의 발현이 감소함을 확인하였다. 지방세포 분화유도후 시행한 oil red O 염색결과 발프로산 처치군에서 지방세포 분화가 감소하였고, 지방분화 관련 유전자의 발현 또한 감소하였다. 분화를 유도하지 않은 군과 백악모세포/골모세포 분화유도군에서 발프로산 처치시 CXCR4 유전자의 발현이 증가하였다.

결론 0.5mM 농도의 발프로산을 치주인대 줄기세포에 반복적으로 처리하였을때, 세포형태의 큰 변화없이 세포증식은 증가하고 세포자연소멸은 감소하는 경향을 띄었다. 반면 1mM, 5mM 의 비교적 고농도의 발프로산은 세포성장을 억제하며, 자연세포소멸 또한 증가시키게 된다. 그리고 발프로산은 골분화 및 지방분화를 억제하며, CXCR4 유전자 발현을 증가시킨다. 이상의 결과는 발프로산이 치주인대 줄기세포에 미치는 영향에 대한 하나의 참고자료가 될 것으로 기대된다.