Control of the molecular interactions among RecQL4, Mcm10 and Ctf4 during the initiation of eukaryotic DNA replication

Abstract

Eukaryotic chromosomal DNA replication consists of sequential recruitments of various proteins on replication origins. The activation of the pre-replicative complex and assembly of an active DNA unwinding complex for the initiation of DNA replication are critical but poorly understood steps. In this thesis, I have studied the interactions among various proteins and the control mechanism of those interactions in human cells. First of all, I have developed the bimolecular fluorescence complementation assay to monitor the assembly of the Cdc45-Mcm2-7-GINS complex (collectively called the CMG complex) in human cells. Using this assay, I showed that the CMG complex was observed only after the G1/S transition of the cell cycle and was abolished by treating cells with either a CDK inhibitor or siRNA against the Cdc7 kinase. Stable association of CMG required all three components of the CMG complex as well as RecQL4, Mcm10 and Ctf4. On the other hand, depletion of TopBP1, a homologue of Dpb11 that plays an essential role in the chromatin binding of Cdc45 and GINS in yeast cells, did not significantly affect the CMG complex formation. These results demonstrate that CDK and Cdc7 kinase control the association of the CMG component proteins, and the assembly of the CMG complex requires the RecQL4, Mcm10 and Ctf4 proteins in human cells. Next, I examined the molecular interaction among RecQL4, Mcm10 and Ctf4, and their association with chromatin and replication origins. RecQL4, Mcm10 and Ctf4 did not only bind to the components of CMG complex in G1 phase, but also interact with each other prior to the assembly of the CMG complex under regulation by both CDK and Cdc7. On the other hand, interaction and chromatin association of these proteins were not dependent on pre-RC. In contrast, replication origin binding of these proteins depends on pre-RC components, Cdc6, as well as the activity of CDK and Cdc7. Finally, I showed that origin binding of RecQL4, Mcm10 and Ctf4 is the target of the checkpoint pathway that prevents the initiation of DNA replication in human cells. The chromatin and origin binding of Ctf4 was impaired in mimosine treated HeLa cells, and this effect was mediated by the stabilization of Hif-1. Furthermore, various DNA damages, such as UV and 4NQO, also reduced the chromatin binding of Ctf4 and origin binding of RecQL4, Mcm10, and Ctf4. These results suggest that checkpoint pathways prevent the entry of S phase or the initiation of DNA replication by preventing the recruitment of RecQL4, Mcm10, and Ctf4 to replication origins. Taken together, I provided the first evidence for the molecular interaction and origin association of RecQL4, Mcm10 and Ctf4, which is essential for the assembly of CMG complex and the initiation of DNA replication. Also, I identified the origin association of RecQL4, Mcm10, and Ctf4 as the target of DNA damage checkpoint pathway that prevents the initiation of DNA replication. All these results indicate the essential role of RecQL4, Mcm10 and Ctf4 for the initiation of DNA replication in human cells.

진핵 세포의 염색체 DNA 복제는 복제 원점에 다양한 단백질들이 순차적으로 결합함으로써 이루어진다. DNA 복제 개시 단계에서 복제 전 복합체의 활성과 DNA를 푸는 단백질 복합체의 활성은 핵심적인 과정이지만, 그 기작에 대해선 자세히 알려져 있지 않다. 본 학위 논문은 인간 세포에 있는 다양한 복제 관련 단백질들 사이의 분자적인 상호 결합과 조절 기작에 대해 다음과 같은 연구를 담고 있다. 첫째로, 이분자 형광 상보 기법 (Bimolecular Fluorescence Complementation assay, BiFC)을 이용하여, 인간 세포에서 Cdc45과 Mcm2-7 및 GINS 복합체 (CMG 복합체)의 분자적 상호 결합을 살펴보았다. CMG 복합체 구성단백질 사이의 상호결합은 세포 주기의 G1/S 이행기에 관찰되며, 이 결합은 CDK의 저해제나 siRNA에 의한 Cdc7 인산화효소의 발현 억제에 의해서 사라진다. CMG복합체의 분자적 상호결합에는 CMG 복합체를 이루는 각 구성단백질뿐만 아니라 RecQL4와 Mcm10 및 Ctf4도 필요하다. 한편, 효모의 Cdc45와 GINS의 염색질 결합에 필수적인 역할을 하는 DPb11의 상동단백질, TopBP1의 결손은 CMG 복합체 형성에 별다른 영향을 미치지 못했다. 이러한 결과들은 인간 세포에서 CDK 및 Cdc7이 CMG 복합체의 구성 단백질이 상호 결합을 조절하며, 이 복합체의 구성에 RecQL4와 Mcm10 그리고 Ctf4이 요구된다는 것을 증명해주는 것이다. 다음 부분에서는 RecQL4와 Mcm10 및 Ctf4의 분자적인 상호 결합과 이 단백질들의 염색질 및 복제 원점과의 상호 결합에 대해 연구했다. RecQL4와 Mcm10 그리고 Ctf4은 G1기에서 CMG 복합체의 구성단백질과 결합하며, 더 나아가 그들 서로도 직접적으로 결합한다. RecQL4와 Mcm10 및 Ctf4은 CMG 복합체보다 앞서 분자적으로 결합하며, 이들의 결합 역시 CDK와 Cdc7 인산화 효소의 조절을 받게 된다. 한편, 이 단백질들의 상호 결합과 염색질 결합은 pre-RC에 의존적이지 않다. 반대로, RecQL4와 복제 원점과의 결합에는 pre-RC 단백질인 Cdc6가 필요하며, CDK 및 Cdc7 역시 요구된다. 마지막으로, 인간 세포에서 RecQL4 및 Mcm10 그리고 Ctf4가 DNA 복제 개시를 억제하는 체크포인트 경로의 목표물임을 밝혀냈다. Ctf4의 염색질 및 복제 원점과의 결합은 미모신이 처리된 HeLa 세포에서 억제된다. 그리고, 이러한 영향은 Hif-1의 안정화를 통해 매개된다. 더 나아가, 자외선(UV)이나 4NQO와 같은 다른 DNA 손상도 역시 Ctf4의 염색질 및 복제 원점 결합과 RecQL4 및 Mcm10의 복제 원점 결합을 억제한다. 이러한 결과들은 체크포인트 경로가 Ctf4의 복제 원점 결합을 방해하는 것으로 S기 진입이나 DNA 복제 개시를 막는다는 것을 보여준다. 종합하면, 이 논문은 RecQL4와 Mcm10 및 Ctf4의 분자적 상호 결합과 복제 원점과의 상호 결합이 DNA 복제 개시 및 CMG 복합체 형성에 있어서 매우 중요하다는 증거를 최초로 제시하여 준다. 또한, RecQL4 및 Mcm10 그리고 Ctf4가 DNA 복제 개시를 억제하는 DNA 손상 체크포인트 경로의 목표물로써 기능한다는 것을 처음으로 밝혀내었다.