감자 바이러스 X의 5' 말단 RNA와 상호작용하는 Nicotiana benthamiana 단백질 및 외피 단백질의 특성 구명

Abstract

감자 바이러스 X (Potato virus X, PVX)는 그들의 복제, 이동, 그리고 입자형성 등 전반적인 바이러스 생활사에 관여하는 stem-loop 구조의 RNA (SL1 RNAs)를 포함한 조절인자 (cis-acting elements)를 genome의 5' 말단에 포함하고 있다. 이 SL1 RNA 들과 상호작용하는 기주 단백질을 찾기 위해 two-dimensional electrophoresis northwestern blot과 proteomics 분석방법을 이용하였고 이를 통해 24개의 담배 단백질을 확보하였다. 이들 중 이 연구에서는 Nicotiana benthamiana 식물에서의 MPB2C homolog protein (NbMPB2Cb)과 DnaJ-like protein (NbDnaJ)의 기능분석을 하였다. NbMPB2b의 기능분석을 위해 먼저 electrophoretic mobility gel shift assay (EMSA)을 수행하였고 그 결과 과발현한 이 단백질은 PVX, Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)가 가진 SL 구조의 RNA와 상호작용함을 확인하였다. 정량적인 RT-PCR 결과 이 단백질은 PVX와 Tobacco mosaic virus (TMV)의 감염에 의해 높은 유전자 발현이 유도되었지만 Cucumber mosaic virus (CMV)의 감염에는 특별한 유전자 발현의 차이를 보이지 않았다. NbMPB2b의 transiently overexpression과 silencing을 유도한 N. benthamiana에서의 실험은 과발현된 식물에서 PVX RNA 축적이 건전체에 비해 확연한 감소를 보였다. 이러한 현상이 바이러스의 복제에 의한 영향인지 이동에 의한 영향인지를 알아보기 위하여 NbMPB2Cb의 overexpression과 silencing이 유지되는 형질전환 N. benthamiana를 얻었고, 이들의 원형질체 분석결과 PVX RNA 축적에 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인하였다. 대조적으로 green fluorescence protein을 fusion한 감염 가능한 PVX 클론을 형질전환체 식물에 도입하여 바이러스의 이동을 추적한 결과 overexpression line에서 이동이 현저히 느려지는 것을 확인하였다. 이 결과들로 미루어보아 NbMPB2Cb는 PVX의 복제가 아닌 이동에 관여된 것으로 보인다. In vivo상 단백질과 단백질간의 상호작용을 알아볼 수 있는 실험 방법들 (BiFC, yeast two hybrid)을 통하여 이 단백질은 PVX이동에 관여된 단백질 중 외피 단백질 (coat protein, CP), 이동단백질 1,2 (TGBp1,2)와 상호작용함을 확인하였다. 공초점 레이저 형광 현미경으로 확인해 본 결과 이 단백질은 세포내의 microtubule (MT)과 plasmodesmata (PD)에 위치함을 보았고, 특히 MT에 위치한 단백질들은 바이러스 감염에 의해 endoplasmic reticulum (ER)으로 재이동함을 확인하였다. 그러므로 NbMPB2Cb 단백질은 PVX의 감염동안 PVX의 cis-acting element인 RNA와 이동관련 단백질들과의 상호작용과 세포 내의 재위치함으로써 PVX의 이동에 영향을 주는 것으로 보인다. NbDnaJ는 northwestern blot 결과에서 negative strand SL1 RNA와 상호작용함을 보았고 이는 EMSA을 통하여 한번 더 확인하였다. BiFC의 분석 결과 이 단백질은 PVX의 CP와 상호작용을 하였고, 이 CP와 상호작용함에 있어서 중요한 도메인을 NbDnaJ의 삭제 돌연변이체를 이용하였다. BiFC의 분석 결과, 이 단백질의 C-terminal 부분이 CP와 상호작용함에 있어서 중요함을 확인하였다. PVX, TMV 그리고 CMV의 감염에 있어서 NbDnaJ 유전자의 발현은 그 양상은 달랐으나 모두 감염에 의해 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한 transiently overexpression과 silencing유도 후 얻은 식물 원형질체의 PVX 감염 분석 결과 이들은 바이러스의 복제에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 또한 GFP fusion의 PVX를 이용한 실험 결과, 이동에도 영향을 주었다. 그러므로 NbDnaJ 단백질은 PVX 감염 시 PVX의 SL1(-)와 CP와의 상호작용을 통해 바이러스 복제와 이동에 관여를 하는 것으로 추측된다. 이전 보고들에서 SL1(+) RNA는 PVX RNA의 assembly를 위한 중요한 요소임을 보여주었다. 이 RNA와 PVX의 CP와의 상호작용에 있어서 SL1(+)의 중요한 염기서열이나 구조를 찾아내기 위해 EMSA, UV cross-linking, 그리고 yeast three-hybrid 분석의 접근 방법을 이용하였다. 이러한 분석 방법은 발현한 CP와 SL1(+) 돌연변이체들을 이용하였다. 그 결과 SL1(+)의 stem C의 stem 길이, loop C와 tetra loop의 염기서열이 CP와의 상호작용에 중요한 요인임을 확인하였다. 이 결과에서 SL1(+) RNA는 RNA 축적에도 중요하지만 CP와의 상호작용에 있어서 특이성을 가짐을 알 수 있었다.

주요어: 감자 바이러스 X, stem-loop RNA, RNA-protein 상호작용, NbMPB2Cb, NbDnaJ, 이동, 복제, 외피 단백질

Potato virus X (PVX) contains cis-acting elements including a stem-loop 1 (SL1) RNA at the 5′ region, which are required for PVX RNA replication, movement, and encapsidation. In this study, 24 tobacco proteins were identified which interacted with SL1 RNAs by two-dimensional electrophoresis northwestern blot analysis. Of the identified host proteins, the MPB2C homolog protein (NbMPB2Cb) was characterized firstly. Electrophoretic mobility gel shift assay (EMSA) demonstrated that NbMPB2Cb bound to SL structures of PVX and Zucchini yellow mosaic virus. qRT-PCR revealed high induction of NbMPB2Cb expression infection by PVX and Tobacco mosaic virus (TMV), but not Cucumber mosaic virus (CMV) suggesting virus specific expression of NbMPB2Cb. PVX RNA accumulation was not altered significantly in protoplasts prepared from wild type and transgenic Nicotiana benthamiana lines upregulated or downregulated for expression of NbMPB2Cb. In contrast, PVX RNA accumulation and movement were reduced by the overexpression of NbMPB2Cb and increased by silencing of NbMPB2Cb, indicating a function for NbMPB2Cb in PVX movement. The bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and yeast two-hybrid assays showed that NbMPB2Cb interacted with multiple PVX proteins including capsid protein (CP), as well as triple gene block protein 1 and 2 (TGBp1 and TGBp2). Subcellular localization studies demonstrated that NbMPB2Cb was associated with microtubules (MTs) and plasmodesmata. In addition, PVX, TMV, and CMV infection altered the subcellular localization of NbMPB2Cb from MTs to endoplasmic reticulum. These results suggest that NbMPB2Cb inhibits PVX RNA movement by interacting with cis-acting elements and PVX movement proteins and by re-localizing in response to PVX infection. In other research, EMSA confirmed that NbDnaJ bound to only PVX SL1 minus-stand RNA. And BiFC experiments indicated that NbDnaJ interacted with PVX CP. Using a series of deletion mutants, the C-terminal region of NbDnaJ was shown to be essential for interaction with the PVX CP. Expression of NbDnaJ was altered significantly upon infection of different plant viruses, such as PVX, TMV, and CMV. However, the expression patterns of NbDnaJ were variable depending on the virus species. In transient experiments, both PVX replication and movement were retarded in plants overexpressing NbDnaJ but enhanced in NbDnaJ silenced plants. Therefore, it is suggested that the newly identified NbDnaJ plays roles in PVX replication and movement by interacting with SL1(-) RNA and PVX CP. Previous research demonstrated that SL1(+) RNA also serves as the origin of assembly for encapsidation of PVX RNA. To identify the essential sequences and/or regions for CP subunit recognition within SL1(+) RNA, EMSA, UV cross-linking, and yeast three-hybrid analyses were experimented. The EMSA and UV cross-linking analyses with PVX CP subunits and RNA transcripts corresponding to the SL1(+) RNA showed that the SL1(+) RNA formed complexes with CP subunits. The EMSA and yeast three-hybrid analyses also were conducted with RNAs containing various mutations of SL1(+) RNA elements. These analyses indicated that SL1(+) RNA is required for the interaction with PVX CP and that the stem length of stem C and the RNA sequences located at the loop C and tetra loop of the SL1(+) are crucial for CP binding. These results indicate that, in addition to being important for RNA accumulation, the SL1(+) RNA from the 5′ region of PVX genome is also required for specific binding of PVX CP.

Keywords: Potato virus X, stem-loop RNA, RNA-protein interaction, NbMPB2Cb, NbDnaJ, viral movement, replication, capsid protein