Modulation of Self-renewal and Differentiation Capability in Human Mesenchymal Stem Cells

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) are among the most valuable cells in stem cell therapy. MSCs have many advantages for clinical applications, including a high proliferative capacity, multilineage differentiation, the capacity to release cytokines, immune modulative effects, migratory ability, and are not carcinogenic adult stem cells (ASCs). As with other stem cells, MSCs have novel stem cell characteristics, such as self-renewal and the ability to differentiate. Thus, for proper clinical applications, it is necessary to adjust the fine control of these characteristics. The simplest way to control stem cells is through the regulation of the culture medum. The growth medium helps the stem cells to maintain their self-renewal, and types of differentiation media induce stem cells to differentiate into each specific lineage. Among the many components of the culture medium, including salts, amino acids, vitamins, cytokines, and growth factors, the latter are critical for stem cell regulation. Most importantly, it has been widely reported that basic fibroblast growth factor (bFGF) promotes the proliferation of human embryonic stem cells (ESCs) and contributes to the maintenance of their self-renewal capability through repeated replications. In contrast to ESCs, the effects of growth factors on hMSCs are poorly understood. In hMSCs, bFGF is associated with an increased number of proliferating cells. Furthermore, the expression levels of pluripotent markers were increased after treatment with bFGF, and bFGF also increased the expression of FGFR, which, in turn, increased the expression of IGFs. Because IGFs exert autocrine and paracrine effects on stem cells, the bFGF-mediated release of IGFs from hMSCs might enhance FGFR1 and IGF1R expression in neighboring cells, and these receptors could subsequently regulate the effects of bFGF and IGFs in adult stem cells. These results suggest that the positive feedback regulation of bFGF and IGFs leads to proliferation and differentiation in hMSCs. Another reliable way to control the behavior of stem cells is through genetic regulation. Several genes are considered key regulators of pluripotency in stem cells, including OCT4, NANOG, c-MYC, KLF4, LIN28 and SOX2. SOX2 is a well-described core transcription factor in ESCs and plays an important role in the maintenance of pluripotency. Recently, SOX2 expression has also been reported in ASCs, but the specific role of SOX2 in ASCs remains unknown. In this study, I examined the molecular mechanisms of SOX2 in hMSCs, a type of ASC, by performing inhibition studies. SOX2 inhibition resulted in altered cell growth and differentiation capabilities, and these changes coincided with a decrease in Dickkopf-1 (DKK1), a soluble inhibitor of WNT signaling. Chromatin immunoprecipitation and luciferase assays showed that SOX2 binds to DKK1 and has a positive regulatory role in transcription. The enforced expression of DKK1 in SOX2-inhibited hMSCs reversed the differentiation defects but could not abrogate the cell proliferation defect. Proliferation was regulated by c-MYC, whose expression can also be controlled by SOX2. Our study shows that SOX2 directly regulates DKK1 expression and, as a consequence, determines the differentiation lineage of hMSCs. Moreover, SOX2 also regulates proliferation by affecting c-MYC. Therefore, these results suggest that, by regulating DKK1 and c-MYC, SOX2 might have a specific function in the differentiation and growth of ASCs, a function that is different from its roles in ESCs. In conclusion, the characteristics of hMSCs can be regulated by applying growth factors or modulating the expression of pluripotent genes. Thus, I can readily modulate self-renewal and induce lineage-specific differentiation. These results are helpful for an effective clinical approach.

중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)는 줄기세포의 임상적용에 있어 중요한 세포 자원 중에 하나이다. 왜냐하면 중간엽줄기세포는 높은 성장력, 다계통 분화능, 사이토카인 (cytokine) 분비, 면역조절 (immune modulation) 작용, 세포 이동 능력 등을 가진 성체줄기세포 (adult stem cell)이기 때문이다. 따라서 중간엽줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ESC)와는 달리 임상 적용시 발암성 여부와 윤리적 문제에서 자유롭다는 이점 또한 갖고 있다. 이러한 중간엽줄기세포는 다른 줄기세포와 마찬가지로 줄기세포로써의 고유한 특성인 자가재생산능력 (self-renewal ability)과 분화능력 (differentiation ability)을 가진다. 그러므로 중간엽줄기세포를 통한 임상적용을 위해서 줄기세포의 특성을 정확히 조절하는 것이 필요하다. 먼저, 줄기세포를 제어하는 가장 쉬운 방법은 세포의 배지를 조절하는 것이다. 예를 들어 성장 배지는 줄기세포가 자가재생능 (self-renewal)을 유지하면서 성장할 수 있도록 하며, 분화 배지는 줄기세포가 특정 세포 계통 (cell lineage)으로 분화할 수 있도록 한다. 이러한 배지에는 염류 (salts), 아미노산 (amino acid), 비타민 (vitamin), 사이토카인, 성장인자 (growth factor)와 같은 많은 성분들이 포함되어 있어 세포의 상태를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 그 중에서도 성장인자는 줄기세포의 조절에 핵심적인 역할을 한다. 염기성섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)는 대표적인 성장인자로써, 인간 배아줄기세포에서 세포 성장을 촉진하고 반복적인 증식 과정 중 자가재생능을 유지할 수 있도록 하는 것으로 잘 알려져 있다. 하지만 중간엽줄기세포에서는 그 역할이 자세히 알려져 있지 않다. 실험 결과, 인간 중간엽줄기세포에서 염기성섬유아세포성장인자는 세포의 증식을 촉진할 뿐만 아니라, 만능성을 나타내는 표지인자를 증가시켰다. 염기성섬유아세포성장인자는 섬유아세포성장인자수용체 (fibroblast growth factor receptor, FGFR)를 증가시켰고, 또한 인슐린유사성장인자 (insulin-like growth factor, IGF)의 발현을 촉진 하였다. 발현된 인슐린유사성장인자는 자가분비 (autocrine)와 근거리분비 (paracrine)를 통해 다시 중간엽줄기세포에 영향을 주었고, 그 결과 염기성섬유아세포성장인자 의해 유도된 인슐린유사성장인자는 인접한 중간엽줄기세포의 섬유아세포성장인자수용체 1 (FGFR1)과 인슐린유사성장인자수용체 1 (IGF1R)의 발현 모두를 촉진시켰다. 수용체들의 연속적인 증가는 성체줄기세포에서 염기성섬유아세포성장인자와 인슐린유사성장인자의 작용을 조절하였다. 이러한 결과는, 염기성섬유아세포성장인자와 인슐린유사성장인자를 통해 유도된 양성피드백 (positive feedback)이 인간 중간엽줄기세포의 증식과 분화를 조절함으로써 성체줄기세포에서 성장인자들의 중요성을 보여주었다. 그 다음으로 줄기세포를 제어하는 확실한 방법은 유전자를 조절하는 것이다. OCT4, NANOG, c-MYC, KLF4, LIN28 그리고 SOX2와 같은 유전자들은 줄기세포의 만능성 (pluripotency)을 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 그 중에서 SOX2는 배아줄기세포에서 핵심적인 전사인자 (transcription factor)로써 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 최근 연구결과에 따르면 SOX2는 배아줄기세포뿐만 아니라 성체줄기세포에서도 발현 하는 것으로 알려져 있지만, 그 기능에 대해서는 아직 밝혀진 바가 많지 않다. 이번 연구에서는, SOX2의 발현을 억제하는 방법을 통해, 성체줄기세포인 인간 중간엽줄기세포에서 SOX2의 분자생물학적 기전을 조사하였다. 그 결과, SOX2의 억제는 중간엽줄기세포에서 성장과 분화의 이상을 초래하였고, 이러한 변화는 윈트 시그널링 (WNT signaling)의 용해성 억제제 (soluble inhibitor)인 DKK1 유전자의 감소와 함께 일어났다. 이는 SOX2 단백질이 DKK1 유전자의 프로모터 (promoter) 부위에 결합 하여 DKK1의 발현을 조절하기 때문이었으며, 이러한 사실은 염색질면역침강 (chromatin immunoprecipitation, ChIP)과 루시퍼라아제 분석 (luciferase assay)을 통해 확인하였다. SOX2가 억제된 중간엽줄기세포에서 DKK1 발현을 증가시켰을 때 세포 분화의 이상은 회복이 되었지만 세포 성장의 이상은 회복되지 않았다. 하지만 DKK1이 아닌 c-MYC의 발현을 증가시켰을 때 세포 성장의 이상이 회복되었는데, 이는 c-MYC 역시 SOX2에 의해 조절되기 때문임을 확인하였다. 앞선 결과를 바탕으로 인간 중간엽줄기세포에서 SOX2가 직접적으로 DKK1의 발현을 조절하여 세포의 계통분화를 조절 하지만, 중간엽줄기세포의 성장에 있어서는 SOX2가 DKK1이 아닌 c-MYC을 통해 조절한다는 것을 밝혔다. 이러한 결과는 성체줄기세포에서 배아줄기세포에서와는 다른 SOX2의 역할을 보여준 것이라 할 수 있다. 본 연구의 결과를 통해 인간 중간엽줄기세포의 고유한 특성이 성장인자와 만능성 유전자 (pluripotent gene)에 의해 제어될 수 있음을 보여주었다. 이는 중간엽줄기세포의 자가재생능과 계통분화를 좀 더 명확하게 조절 할 수 있는 방법을 제시하였다고 사료된다. 따라서 본 연구의 결과를 바탕으로 성체줄기세포인 중간엽줄기세포에서 자가재생산능력과 분화능력을 조절함으로써 다양한 질병의 임상적용에 기여할 수 있을 것이다.