Roles of translation factors related to RNA virus infection in plants

Abstract

Virus resistance genes provide a highly efficient barrier to virus infection in plants. Recessive resistance has been recognized for a long time and more than half of the 200 known virus resistance genes in plants are recessively inherited. Some of these have been cloned from various crop species and all of these resistance genes were related to the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E), 4G (eIF4G) and their isoforms. Viruses affected by loss of function of either eIF4E or its isoform eIFiso4E belong mainly to the potyviruses. Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) belongs to the genus potyvirus and one of the most predominant viruses in pepper in Asia. In the first chapter, in order to test the involvement of eIF4E and eIFiso4E in ChiVMV infection in pepper, I conducted a genetic analysis using a segregating population derived from a cross between Capsicum annuum 'Dempsey' containing an eIF4E mutation (pvr12) and C. annuum 'Perennial' containing an eIFiso4E mutation (pvr6). C. annuum 'Dempsey' was susceptible and C. annuum 'Perennial' was resistant to ChiVMV. All F1 plants showed resistance, indicating that resistance is a dominant trait conferred by C. annuum 'Perennial'. The segregation data of F2 populations fit a 13:3 ratio of resistant to susceptible indicating that a two-gene-model of dominant and recessive epistasis for ChiVMV resistance. To investigate the effects of recessive resistance gene on ChiVMV infection, I selected individuals susceptible to ChiVMV from the F2 segregating population and use them to generate the F3 segregating population. I found all F2 and F3 plants containing homozygous genotypes of both pvr12 and pvr6 showed resistant to ChiVMV. In protein-protein interaction experiments, ChiVMV viral genome-linked protein (VPg) interacted with both eIF4E and eIFiso4E. In addition, silencing of eIF4E and elFiso4E showed reduced accumulation level of ChiVMV. These results indicated that ChiVMV can use both eIF4E and eIFiso4E for replication, making simultaneous mutations in eIF4E and eIFiso4E necessary to prevent ChiVMV infection in pepper. However, a large number of natural resistance genes have yet to be characterized, and screens of mutagenized host populations have found susceptibility factors other than the eIF4E or eIF4G families. In the second chapter, to identify new host factors and their contribution to virus susceptibility, host genes required for mRNA translation were silenced in N. benthamiana, which were then infected with Tobacco mosaic virus (TMV), Cucumber mosaic virus (CMV), or Potato virus X (PVX) each expressing the green fluorescent protein (GFP). Reducing expression of eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) or 1B (eEF1B) greatly inhibited local and systemic spread of TMV-GFP, CMV-GFP and PVX-GFP indicating that eEF1A and eEF1B are commonly used by these RNA viruses in their multiplication. When I tested the interactions between elongation factors and viral components, both Capsicum eEF1A and eEF1B proteins directly interacted with the methyltransferase domain of TMV RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), the 2b protein of CMV, and the triple gene block 1 protein (TGBp1) of PVX by the yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays. These results suggest that eEF1A and eEF1B play essential roles in the multiplication of several RNA viruses by physically interacting with viral components. In addition, I found that the deletion mutant of eEF1A domains I or II disrupted interactions with viral proteins. It is suggested that domains I and II of eEF1A could be linked to interactions with viral proteins.

바이러스가 식물에서 성공적으로 증식하기 위해서는 기주-바이러스 간의 적절한 상호작용이 필요하며, 식물체에 이러한 상호작용에 필요한 기주인자가 없을 경우 바이러스에 대한 저항성을 가지게 된다. 식물 바이러스 증식에는 다양한 기주인자가 관여될 것으로 생각되나, 현재까지 알려진 열성 저항성 유전자는 모두 진핵생물의 단백질 번역 개시인자인 eIF4E와 eIF4G 그룹에 해당한다. 또한 이와 관련된 바이러스 저항성은 대부분 Potyvirus와 관련되어 있다. 첫 장에서는 eIF4E와 그것의 isoform인 eIFiso4E가 고추에 심각한 피해를 입히는 Chilli veinal mottle virus (ChiVMV, Potyvirus의 일종)의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 eIF4E에 돌연변이를 포함하는 C. annuum Dempsey (pvr12)와 eIFiso4E에 돌연변이를 포함하는 C. annuum Perennial (pvr6)을 이용하여 분리집단을 만들었다. C. annuum Dempsey는 ChiMV에 대해 감수성을 가지며, C. annuum Perennial는 ChiVMV에 대해 저항성을 나타낸다. F1 식물체는 모두 저항성을 보였으며, 이는 C. annuum Perennial의 저항성은 우성 저항성 유전자의 영향임을 의미한다. 여기서는 ChiVMV에 대한 열성 저항성 유전자 eIF4E와 eIFiso4E의 영향을 확인하기 위해 우성 저항성의 영향을 배제하고자 하였다. 이를 위해 감수성의 F2개체를 선발하여 F3 집단을 만들었으며 이들을 이용하여 바이러스 검정을 실시하였다. pvr12와 pvr6에 대한 분자마커를 이용하여 75개의 F2와 329개의 F3 개체(17개의 family)의 유전형을 분석한 결과, pvr12와 pvr6를 homozygous로 가지는 개체는 ChiVMV에 대한 저항성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 단백질 상호작용 연구를 통하여 ChiVMV VPg 단백질이 eIF4E와 eIFiso4E 단백질 모두와 상호작용 할 수 있음을 확인하였으며, 고추에서 eIF4E와 eIFiso4E 유전자를 silencing하면 ChiVMV의 세포 내 축적이 급격하게 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 ChiVMV가 eIF4E와 eIFiso4E 모두를 바이러스 증식에 이용할 수 있음을 보여주는 것이며, 고추에서 eIF4E와 eIFiso4E 모두에 연속적인 돌연변이를 유도할 경우 ChiVMV에 대한 저항성을 유도할 수 있음을 의미한다. 바이러스 감염에 중요한 역할을 하는 기주인자를 발굴하는 것은 바이러스 증식 기작을 이해하고 바이러스 저항성 작물을 개발하는 데 첫걸음이 된다. 두 번째 장에서는 바이러스 증식에 필요한 기주인자를 새롭게 발굴하기 위해 mRNA의 번역에 관여하는 식물의 유전자를 N. benthamiana에서 VIGS를 이용하여 발현을 억제한 후, GFP가 포함되어 있는 TMV (TMV-GFP), CMV (CMV-GFP), PVX (PVX-GFP)를 접종하였다. 억제한 식물 유전자 중, eEF1A와 eEF1B를 silencing한 식물체에서 TMV-GFP, CMV-GFP, PVX-GFP의 증식이 모두 억제되는 것을 확인하였다. 이것은 eEF1A와 eEF1B가 이러한 RNA 바이러스의 증식에 매우 중요하게 관여하고 있음을 의미하는 것이다. 또한 이러한 기주인자와 바이러스 단백질 간의 상호작용을 yeast two-hybrid와 bimolecular fluorescence complementation 분석 방법을 이용하여 확인한 결과 고추의 eEF1A와 eEF1B 단백질이 TMV RdRp의 methyltransferase doamin과 CMV 2b, 그리고 PVX의 triple gene block 1 (TGBp1) 단백질과 상호작용하고 있음을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 eEF1A와 eEF1B가 바이러스 단백질과의 직접적인 상호작용을 통해 다양한 RNA 바이러스 증식에 공통적으로 관여하는 중요한 기주인자임을 의미한다. 또한 eEF1A의 domain I과 domain II에 결손 돌연변이를 유도한 경우, 이들 바이러스 단백질과의 상호작용이 억제되는 것을 확인하였으며 이는 eEF1A의 domain I과 domain II가 바이러스와의 상호작용에 밀접하게 연관되어 있음을 의미한다.