NK/T 세포 림프종에서 DNA 과메틸화에 의해 발현이 억제되는 microRNA의 스크리닝 및 조절기전 분석

Abstract

NK/T 세포 림프종(NK/T cell lymphoma, NKTL)은 엡스타인 바 바이러스와 높은 관련성을 보이는 악성 종양으로 주로 림프절외 장기에서 발생하며 심한 괴사와 혈관손상을 특징으로 한다. 암화 과정에서 관여하는 몇몇 유전자 변화가 보고되고 있으나 그 조절기전에 대해 알려진 바는 적다. 그러나 다른 엡스타인 바 바이러스 관련 악성종양과 마찬가지로 종양세포에서 여러 유전자들의 메틸화가 비교적 빈번하게 관찰되어 발암기전의 하나로 여겨지고 있다. microRNA (miRNA)는 19- 에서 25- 뉴클레오타이드 크기의 단백질을 코딩하지 않는 작은 크기의 RNA로 표적 유전자의 발현을 음조절하는 역할을 한다. 최근 miRNA의 발현이상이 종양의 병태생리와 관련되어 있음이 밝혀졌고 몇몇 miRNA들은 종양촉진유전자 혹은 종양억제유전자로서의 기능을 한다는 결과들이 보고되었다. miRNA의 발현이상은 해당유전자의 소실이나 변이 등 유전자적인 변화뿐만 아니라 프로모터 CpG 부위의 메틸화에 의한 후생유전적인 변화에 의해서도 기인함이 알려져 있다. 따라서, 저자들은 엡스타인 바 바이러스와 연관된 대표적인 악성 종양인 NK/T 세포 림프종에서 DNA 메틸화에 의해 발현이 이상 억제되어 있는 miRNA 들을 찾고 이들의 기능과 조절기전을 확인하여 새로운 종양억제 miRNA를 제시하여 NKTL의 발암기전에 대한 이해를 높이고 새로운 표적 치료 물질을 제시하고자 하였다. NK 세포 림프종/백혈병 세포주에서 탈메틸화 시약 처리 시 발현이 증가되는 miRNA들을 microarray 분석과 정량적 역전사중합효소연쇄반응법을 통해 스크리닝하였다. NKTL 세포주의 생존능에 미치는 영향을 평가하기 위하여 miRNA들의 유사체를 트렌스펙션하여 CCK8 측정법을 수행하였다. 생존능에 영향을 미치는 것으로 판단되는 miRNA들의 표적유전자를 in silico 분석을 통하여 예측하고 이 중 NKTL의 유전자 변화와 관련있는 miRNA 들을 선정하였다. 선정한 miRNA들이 실제로 NKTL의 세포의 mRNA 발현을 조절하는지 여부 확인을 위해 정량적 및 반정량적 역전사중합효소연쇄반응법을 수행하여 평가하고 단백질 발현의 조절 여부 평가를 위하여 웨스턴 블롯법을 수행하였다. SNK6 세포주에서 탈메틸화 시 microarray로 조사한 총 888개의 miRNA 중 77개가 1.3배 이상 증가하였다. 정량적 확인을 위한 정량적 역전사중합효소연쇄반응법 결과, 총 8개의 miRNA들이 탈메틸화 시 두 배 (2^(-ΔΔCt)) 이상 증가하였다. 세포 생존능 평가를 위한 CCK8 분석에서 miR-1275, miR-134, miR-20b, miR-376a, miR-654-3p, miR-143, miR-181c, miR-379가 NKTL의 생존능에 영향을 미칠 가능성이 있음을 확인하였다. NKTL의 암화과정에서 주요한 경로로 작용할 것으로 판단되는 PDGFRα 경로와 그 하위 경로인 AKT 경로, JAK-STAT 경로, 그리고 p53 이상, MYC 유전자의 활성화, NFκB 경로에 속한 유전자들과 주요 암화경로 중 하나인 kRAS 경로에 해당하는 유전자들을 표적으로 하는 miRNA들을 선정하고 각각의 표적유전자들을 웹기반의 데이터베이스를 통해 예측하였다. 그 결과 miR-20b, miR-143, miR-181c를 최종 후보 miRNA로 선정하였다. 정량적 역전사중합효소연쇄반응법으로 확인했을 때, miR-20b는 예상 표적 유전물질인 PDGFRαmRNA, STAT3 mRNA, AKT3 mRNA, miR-143은 PDGFRα mRNA, miR-181c는 kRAS mRNA 발현을 억제하였다. 여러 데이터베이스에서 공통적으로 miR-143과 miR-181c는 kRAS를 표적 mRNA로 예측하고 있었으나 정량적 역전사중합효소연쇄반응법과 웨스턴 블롯법으로 확인한 결과, SNK6 세포주에서는 miR-181c만 kRAS 특이적으로 mRNA를 억제시킬 뿐만 아니라 (P = 0.013) 단백질 발현도 억제하였다. 반면에 miR-143은 kRAS mRNA와 단백질의 발현 정도에 영향을 미치지 않았다. kRAS경로는 많은 암종에서 주요 암화경로 임에도 NKTL에서는 유전자의 돌연변이 빈도 정도만 보고되어 있어 실제로 kRAS 경로가 NKTL의 생장에 영향을 미치는지 여부를 먼저 확인하였다. RAS의 활성 억제제인 salirasib을 SNK6 세포주에 처리하고 CCK8 분석을 한 결과 농도와 처리 후 경과 시간에 따라 세포 생존능이 감소함을 발견하였고 이는 kRAS 경로가 NKTL에서 암화경로의 하나로 작용할 가능성을 시사했다. DNA의 탈메틸화가 후보 miRNA의 발현을 증가 시킴에 따라 이의 표적 물질인 kRAS가 감소되어 조절경로가 억제될 것이라는 가정 하에 탈메틸화 시약인 5-AzadC를 처리하였고 그 결과 kRAS와 ERK1/2, STAT3 단백질의 양과 활성이 감소하였다. 한편, miR-181c의 유사체를 세포주에 트렌스펙션 했을 때, kRAS 단백질의 총량뿐 아니라 kRAS 경로를 통해 인산화가 조절되는 것으로 알려진 STAT3의 serine 727 부위의 인산화가 억제되고 STAT3의 활성에 의해 조절되는 것으로 알려진 VEGF mRNA의 발현이 감소되었다. 반면 salirasib을 처리한 경우에는 kRAS 단백질 양의 변화 없이 STAT3의 활성화만 감소되어 miR-181c가 kRAS mRNA의 발현을 억제하여 kRAS 단백질의 생성을 억제하고 그 하위 신호전달 경로를 억제함을 확인하였다. 또한, SNK6 세포주에 miR-181c 유사체를 처리하면 세포 생존능이 감소하였으나 (P = 0.023) kRAS를 과발현 시키면 세포 생존능이 다시 회복되었으며 (P = 0.012) 이를 통해 miR-181c가 kRAS를 억제함을 한 번 더 확인하였다. NKTL의 포르말린고정-파라핀봉입 블록 조직에서 mir-143(P = 0.001), mir-181c (P < 0.0001), mir-20b (P < 0.0001), mir-379 (P < 0.0001)의 발현 양이 대표적인 암화 유전자인 mir-21에 비하여 상대적으로 매우 저하되어 있음을 확인하였고 통계적 유의성은 없었지만(P = 0.091) miR-181c와 kRAS mRNA 간에 음의 상관관계의 경향성을 관찰하였다(Spearman rank correlation coefficient, ρ = -0.468). 한편, 메틸화특이적중합효소연쇄반응법을 통해 SNK6 세포주에서 miR-181c의 메틸화 되어 있던 프로모터 CpG 부위가 5-AzadC 처리 후 탈메틸화가 일어나는 것을 반정량적으로 확인할 수 있었다. 결론적으로 본 연구를 통해 NKTL에서 DNA의 메틸화에 의해 발현이 억제되어 있으며 종양억제 기능을 할 것으로 기대되는 miR-20b, miR-143, miR-181c 등 몇몇 miRNA들을 찾을 수 있었으며 각각의 miRNA들이 NKTL의 암화경로에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있던 몇몇 표적 종양 유전자들의 mRNA의 발현을 억제함을 확인하였다. 특히, miR-181c는 kRAS 단백질의 발현을 억제하여 kRAS-STAT3 신호전달경로를 차단하고 결과적으로 VEGF mRNA의 발현을 억제함을 확인하였다. 따라서, 본 연구는 NKTL에서 후생유전학적으로 발현이 억제되어 있는 새로운 후보 종양억제유전자를 선별하였고 이들 중 특히 miR-181c의 기능과 조절 경로를 확인했다는 점에서 의의가 있다고 하겠다.