상염색체 우성 다낭신 질환에서 돌연변이 polycystin-1 단백의 기능 변화 고찰

Abstract

상염색체우성 다낭신 (이하 ADPKD)은 1:1000의 유병률을 갖는 비교적 흔한 유전질환으로 신장내 낭포가 형성되고 그 크기가 커지면서 신부전이 진행되는 특징을 갖는다. ADPKD의 큰 특징은 신장이나 기타 다른 장기의 상피 세포가 수액이 가득찬 낭포를 형성하고 그 수와 크기가 계속 커진다는데 있다. 이 질환의 원인 유전자는 크게 PKD1과 PKD2가 있는데 전체 질환의 85% 정도는 PKD1 유전자의 돌연변이에 의해 발병한다. PKD2에 의한 질환은 전체의 약 15% 정도를 차지한다고 보고되고 있다. 그러나 이 외에 낭포의 형성과 성장의 분자적 기전은 잘 알려져 있지 않는데 낭포 형성, 섬유화, 형질과 유전자 형의 상관관계 등의 기전 연구를 위한 ADPKD 신장 샘플이 부족하고 이로 인해 낭포로부터 세포를 얻어서 사용하는게 어렵기 때문이다. 따라서 본 연구에서는 네 명의 ADPKD 환자로부터 신장을 얻어 낭포를 분리하고 세포주화 하여 그 특성을 밝히고자 하였다. 확립한 모든 낭포 세포주는 PKD1 유전자에 대한 돌연변이를 갖고 있고 원위 세뇨관 및 근위 세뇨관/집합관으로부터 유래한 세포가 골고루 확보되었다. 다음으로 활성화된 칼페인에 의한 polycystin-1(이하 PC-1) C말단 분해에 따른 신호전달체계 변화를 연구했다. PC-1의 C 말단 부위에 PEST 서열이 존재함으로 PEST-FIND 프로그램으로 예측하였다. PEST 서열은 칼페인에 의해 인지되어 분해를 촉진하는 서열로 알려져있다. PC-1은 칼페인에 의해 직접적으로 분해되고 분해 후 그 기능에 변화를 가져왔다. JAK2의 인산화는 감소하였고, 반면 ERK의 인산화는 증가하는 신호전달체계의 변화가 생겼으며 JAK2와 ERK간의 상관관계를 없는 것으로 저해제 처리 실험을 통해 확인하였다. 그 후로, 칼슘의 항상성과 ADPKD 유발 사이의 관계를 확인하기 위해, 앞서 확립한 낭포 유래 세포주에서 칼슘 레벨을 측정한 결과 전체 세포주 중 하나의 세포주에서 정상 세포에 비해 칼슘 레벨이 높았다. 그러므로 칼페인에 의한 PC-1의 분해가 야기하는 세포내 칼슘의 항상성 붕괴는 ADPKD의 하나의 발병 원인이 될 수도 있음을 암시한다. 결론적으로, 본 연구에서는 서로 다른 ADPKD 신장의 낭포로부터 유래한 세포주를 확립하여 그 특성을 발혔다. 이들 세포는 상피세포로 다양한 세뇨관으로부터 유래했으며 ADPKD의 특성도 유지하고 있다. 또한 이들 모두 PKD1 유전자의 돌연변이가 있음을 확인하였다. 그러므로 이 세포주들은 세포 분열, 세포간 상호작용, 신호전달, 유전형-표현형 상호 관계등을 포함한 낭포 형성에 대한 기전 연구를 촉진시킬 것이다. 또한 본 연구에서는 PC-1이 PEST 서열을 가지고 있고 이로 인해 칼페인에 의해 분해가 됨을 알았다. 이런PC-1의 분해는 JAK2 의존적인 신호전달계와 ERK 의존적인 신호전달계에 각각 독립적으로 영향을 미치고 있음을 확인하였고 최종적으로 칼슘 항상성의 붕괴에 따른 칼페인 활성은 ADPKD의 발병 원인 중 하나가 될 수 있음을 확인하였다.

Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), one of the most common inherited disorders with a frequency of 1 in 1000, is characterized by the development of gradually enlarging renal cysts and progressive renal failure. The hallmark of ADPKD is the progressive expansion of multiple innumerable fluid-filled cysts derived from tubular epithelia in kidney and other organs. The vast majority of patients are affected by mutations in PKD1 or PKD2. PKD1 is mutated in more than 85 % of ADPKD patients, and it encodes polycystin-1(PC-1). PKD2 encodes polycystin-2 (PC-2), that is an integral membrane protein with six transmembrane domains and it is mutated inaffects approximately 15 % of all patients. However, the pathogenetic mechanism of cyst formation and growth is not well understood. Studies of the mechanisms of cyst formation, fibrosis and of genotype-phenotype correlations have been hampered by difficulties in obtaining ADPKD kidney specimens and by the lack of available and useful reliable cyst-derived cell lines. Therefore, in thisThis study I described the isolation of the renal cyst epithelial cells from 4 patients with ADPKD, subsequent immortalization and characterization of 4 epithelial cell lines from individual cystsprimary cells from 4 different ADPKD kidneys of Korean patients, in addition to a normal tubule cell line. All of these cells have hada PKD1 gene defects and are were derived from cysts of both proximal and distal tubule origin. Next, the alteration of signaling pathway responsible for degradation of C-terminus of PC-1 by activated calpains. A PEST domain was found to be present in I found that polycystin-1 contains a PEST domain in C-terminal intracellular region of PC-1 by using the PEST-FIND program. The PEST sequences are considered to becan be recognized by specific proteases, particularly calpains, a members of the calcium-activated cysteine protease family. C-terminal region of I found that PC-1 was directly degraded by activated calpain in in vitro degradation assay. This induced the change of After cleavage, the function of PC-1 interaction with JAK2 and ERK: was changed to reduction of JAK2 phosphorylation and induction of ERK phosphorylation. Inhibition of phosphorylated JAK2 by JAK2 inhibitor treatment has shown that these two signaling pathways have had a distinct roles independently each other. Further, I measured the intracellular Ca2+ levels in cyst-derived cell lines were measured to define the link between the alteration of intracellular calcium homeostasis and the progression of ADPKD. Intracellular calcium levels were shown One of cell lines has shown to be higher in one of our cell lines increased intracellular calcium level than control (normal renal epithelial cells). Therefore, breakdown of Ca2+ homeostasis and subsequent PC-1 degradation by activated of calpains induced by breakdown of Ca2+ homeostasis can may be one of pathogenesis of ADPKD. In conclusion, this study described that the development and characterization of several immortalized cell lines derived from different ADPKD kidneys. These were epithelial cells and originated from proximal or distal tubules/collecting ducts, also had some characteristics of ADPKD. Therefore, tThese new cell lines should would facilitate studies of the mechanism of cyst formation, including cell proliferation, cell-cell interaction, signal transduction, and genotype-phenotype relationship. And Moreover, this study demonstrated that PC-1 had a PEST sequences in the cytosolic termini and is a novel substrate for both of - and m- calpains. Calpain-induced PC-1 degradation altered , and degraded PC-1 by calpain regulated JAK2-dependent and ERK-dependent signaling pathways independently in separated process. Finally, calpain activation induced by alteration of calcium homeostasis might be one of pathogenetic mechanisms in ADPKD.