Peptide for targeted drug delivery and tissue regeneration

Abstract

기존에 사용 되고 있는 단백질의약품 및 고분자물질들은 물질이 가지고 있는 세포 친화성 및 치료효과만으로는 우수한 것이 많으나 물질이 가지고 있는 고분자적 특성에 따라 체내에서 쉽게 흡수되어지지 못하거나 단백질 약물로 인해 면역반응을 일으키는 등의 한계가 있다. 또한 이러한 단백의약품의 작용은 다양한 수용체를 기반으로 하여 목적하는 수용체와 작용하는 도메인 역시 확보되지 못한 상황이다. 이에 단백질에서 주요 도메인만을 분리하여 고체상 합성방법으로 만들어진 생리활성 펩타이드는 단백의약품의 한계를 완화시키는 등 여러 이점으로 신개념의 재료를 제공할 수 있다. 또한 펩타이드는 자체의 의약생리활성뿐만 아니라 세포내의 전달체 역할을 할 수 있는데, 이는 기존 방법으로 도달이 어려운 세포 내 투과를 극복할 수 있는 대안이 될 수 있다. 특정의 염기서열과 결합해 유전자 발현을 억제시키는 물질로 발견된 짧은 간섭 RNA (siRNA)는 최근 질병원인 단백질 발현을 억제함이 보고되어 치료목적으로 각광받고 있는 물질이지만, 낮은 세포 내 투과율이라는 장벽에 부딪히고 있다. 펩타이드 기반 고기능성 나노 약물수송체 (low molecular weight protamine - LMWP)를 본 연구에서 활용하여 LMWP-siRNA 결합체와 기존 제제와의 항암기능성 비교 연구함으로써 종양 치유과정을 모니터링 하였다. 그 결과 아무것도 처리하지 않은 세포와 VEGFsiRNA만 처리한 세포에 비교하여, LMWP수송체와 VEGFsiRNA 복합체를 처리한 세포의 혈관내피세포 성장인자가 50%내로 더 적게 발현되었으며, LMWP/VEGFsiRNA농도가 증가할수록 혈관내피세포 성장인자 발현율이 적은 것으로 나타났다. LMWP/VEGFsiRNA약물을 투여했을 때, 대조군에 비해 시험군 투여 시 2주 후부터 종양의 크기가 줄어들기 시작해 약 60일 이후에 종양이 거의 사라지는 양상을 보였다. 또한 조직재생 기능성 펩타이드를 발굴하였는데 본 연구에서는 손상조직의 복원과정 중 형성되는 피브린과 결합능이 좋은 펩타이드를 이용해 생체모사환경을 조성하고자 하였다. 생체재료의 표면개질은 세포의 부착이나 증식, 분화력을 증가시키기 위해 수행하는 실험방법이다. 표면개질 방법은 크게 물리적 표면개질과 화학적 표면개질 방법이 있고, 물리적 표면개질법 중 코딩법이 가장 손쉽게 사용되는 방법이기는 하지만 오랜기간 표면개질의 효과를 기대할 수가 없다. 이에 반해 화학적 표면개질 방법은 표면에 생리활성펩타이드나 기능성 단백질을 전기적 또는 화학적 가교제를 사용하여서 부착함으로써 보다 안정적인 효과를 낼 수 있다. 하지만 화학적 가교제를 사용할 때는 생체재료 구조에 변형을 가지고 올 수 있으며, 붙여주는 펩타이드의 활성에도 영향을 주는 단점이 있다. 이에 본 실험에서는 친화력을 이용해 피브린 매트릭스에 피브로넥틴에서 유래한 생리활성 펩타이드 부착시키고 세포의 부착력을 높이는 실험을 실시하였다. 표면 플라즈몬 공명법을 이용해 피브린과 부착친화력이 가장 좋은 펩타이드를 선별하였고, 약물방출실험 결과 피브린과 친화력이 가장 좋은 FND 1-1 펩타이드가 가장 많이 피브린 매트릭스에 머물러 있는 것을 확인하였다. 첨가한 FND 펩타이드는 젤화 시간이나 안정성에 영향을 미치지 않았지만 피브린 고분자들 간에 상호작용이 증가하고 세포부착이 증가하는 효과를 가지고 왔다. 열중량분석기를 통해 피브린 매트릭스의 분해정도를 확인한 결과 FND 1-1 펩타이드를 넣은 피브린 매트릭스 그룹이 가장 높은 온도에서 분해 되었으며 이는 FND 1-1 펩타이드가 상호침투 고분자 가교구조 (IPN : interpenetrating polymer network)를 돕는 것으로 사료된다. 주사전자현미경을 이용해 관찰한 결과 FNDⅠ-1을 첨가한 피브린 매트릭스에서 세포의 부착 양상이 방추형태를 띄며 안정적으로 일어나고 있음을 확인하였다. 국소 부착 키나아제의 활성화 정도를 특수단백질 검출검사법으로 확인한 결과에서도 이와 동일하게 FNDⅠ-1을 첨가한 피브린 매트릭스에서 더 많은 세포 증식을 보였다. 이와 같은 실험 결과를 통해 기존의 약물이나 조직재생 지지체에 생리활성 펩타이드를 도입함으로써 기능의 증가를 기대할 수 있다. 세포생리활성 펩타이드를 기반으로 하는 세포 투과성 신소재, 조직재생 기능성을 발굴하여 기존의 방법으로는 치료효과 발휘가 어려운 약물에 신규 펩타이드 수송체를 활용할 수 있으며, 기존의 지지체에 조직재생 기능성 펩타이드를 적용하여 조직 재생기능의 증가를 기대할 수 있다.

Bioactive peptides can be obtained from biological or chemically synthesized sources, increasing their specific cellular responses for drug delivery and tissue growth. Compared to using an entire protein in regenerative therapy, these bioactive peptides demonstrate potential advantages including overcoming possible immunogenicity, being less susceptible to degradation, and producing fewer tumor-related side effects as well as providing almost similar bioactivity to protein. And several peptides, termed as cell penetrating peptides (CPP) can trigger the movement of a cargo molecule across the cell membrane into the cytoplasm of cells and improve its intracellular routing, thereby facilitating interactions with the target. Gene delivery is the process of introducing foreign DNA/RNA into host cells. Gene delivery is, for example, one of the steps necessary for gene therapy and the genetic modification of crops. There are many different methods of gene delivery developed for a various types of cells and tissues, from bacterial to mammalian. The polyanionic charges carried by siRNAs, used for specific down-regulation of target genes, however, restrain cellular uptake and consequently limit effects on gene regulation. Herein the authors describe a peptide/siRNA complex containing the cell penetrating peptide derived from natural protamine, termed low molecular weight protamine (LMWP). The increased cell uptake of siRNA that was achieved using the LMWP resulted in significant down-regulation of model protein luciferase as well as therapeutic cancer target, vascular endothelial growth factor (VEGF) expression. The LMWP-based systemic delivery method could be a reliable and safe approach to maximize effectiveness of therapeutic siRNA for treatment of cancer and other diseases. Biomaterials, including fibrin, collagen and PLA, have been attempted as tissue regenerating scaffolding materials. Biomaterials have a modified surface that induces cell adhesion and migration has been premise for optimal tissue creation. Fibrin has been employed as a tissue regenerative scaffold especially for tissue regeneration and has been chemically surface modified to present bioactivity. Herein, we show that peptides, denoted as fibronectin derived (FND) peptide identified from fibronectin protein, was able to specifically bind fibrin without chemical conjugation, while presenting cell binding capability in vitro. Three fibronectin derived peptides were manually synthesized by the F-moc chemistry using a peptide synthesizer. The present study has assessed a simplified version of a fibrin matrices prepared by using solutions containing fibrinogen, fibronectin derived (FND) peptides, thrombin, calcium and aprotinin. The direct binding kinetics of FND peptides was examined using surface plasmon resonance (SPR)-based BIAcore technology. FND I-1 peptide interacts strongly with the fibrin(ogen). This result affects by FND peptide release rate from FND peptide loaded fibrin matrices. However material properties (clotting time and mechanical stability) were not influenced by the FND peptides. And FND I-1 peptides incorporated into fibrin matrices promotes cell spreading and cytoskeletal organization that is very different from that seen on fibrin alone. Taken together, the FND I-1 peptide loaded fibrin matrices can be utilized as a cell culture scaffold in tissue regeneration.