Screening of P450s and their electron transfer proteins from Streptomyces avermitilis MA4680 for regiospecific hydroxylation of (iso)flavonoids

Abstract

The ability of the cytochrome P450 heme monooxygenases to catalyze difficult oxidation reaction, often with high specificity and selectivity, makes them attractive for numerous biotechnological applications. However they are generally limited by low turnover rate and low stability, and their minimum requirement for catalysis include a cofactor as source NAD(P)H, partner proteins for electron transfer, and dioxygen. Here, in this thesis we attempted to deal with these issues in detail. Our goal was to identify the P450s which catalyze the regiospecific hydroxylation of isoflavonoids substrates, development of the host and identification of electron transfer system in Streptomyces avermitilis MA4680 Screening of cytochrome P450 monoxygenases responsible for the regiospecific hydroxylation of flavones, isoflavones and chalcones was attempted using a P450 library constructed from Streptomyces avermitilis MA4680 and Nocarida farcinica IFM10152, among the screened P450 library pools, four cytochrome P450s, i.e. CYP107Y1, CYP125A2 and CYP107P2 and CYP105D7 from S. avermitilis showed hydroxylation activities towards flavones and isoflavones. Further analysis identified that CYP107Y1 (sav2377), CYP125A2 (sav5841), CYP107P2 (sav4539) and CYP105D7 (sav7469) showed regiospecific hydroxylation activities towards genistein (7,4',5 -trihydroxyisoflavone), chrysin (7,5 -dihydroxyisoflavone), apigenin(7,4',5-dihydroxyisoflavone) and daidzein (7,4-dihydroxyisoflavone) to produce 7,3',4',5-tetrahydroxyisoflavone, B-ring hydroxylated 5,7-dihydro- xyflavone, 7,3',4',5-tetrahydroxyflavone and 7,3',4'-trihydroxyisoflavone respectively. Since, in vitro P450 biocatalysis would require continuous regeneration of the expensive cofactor NAD(P)H from NAD(P)+, adding complexity and cost to the reaction system. It was essential to develop the host based whole cell system to overcome these issues. Here, we have reported that S. avermitilis can be used as a host for the biotransformation of the isoflavonoids. Using recombinant S. avermitilis overexpression CYP105D7, it could be possible to produce 37 mg/L of 7,3',4'–trihydroxyisoflavonoids (3'-ODI). However, degradation of daidzein and its hydroxylated metabolites 7,3',4'-trihydroxyisoflavone was observed in S. avermitilis host system. We have identified that tyrosinase from S. avermitilis function as a suicide substrate for the isoflavonoids. Further deletion of tyrosinase from S. avermitilis prevents the degradation of daidzein as well as its hydroxylation metabolites. However the production yield is very low in tyrosinase (ΔmelC2) deletion mutant. Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis revealed that, ΔmelC2 greatly affects the expression of FDRs, Fdx and CYP105D7. Among 33 P450s, 9 ferredoxin and 6 ferredoxin reductase, none of these FDR and Fdx was characterized yet regarding their electron transfer efficiency toward the P450s. Sufficient detail about the relevant homologous electron transfer system in Streptomyces P450s is unclear. Several approaches like gene expression analysis of FDR and Fdx, deletion of FDRs from S. avermitilis chromosomes and further the in vitro reconstitution of FDRs and Fdx, we have identified the primary electron transfer pathway for P450 as being NADPH→FdxH→FprD→CYP105D7.

사이토크롬P450은 Heme을 갖고 있는 모노옥시다아제로서, 특이적이고 선택적인 산화 반응을 촉매화한다. 그러나, 낮은 회전율과 낮은 안정성, NAD(P)H와 같은 조효소와 전자 전달 단백질을 필요로 하기 때문에 P450의 생물공학적 응용에 한계가 있다. 본 연구는 아이소 플라보노이드의 위치특이적 수산화 반응을 매개하는 P450을 스크리닝하고 S. avermitilis를 이용한 숙주개발 및 전자 전달 시스템을 규명하는 연구를 다루고 있다. 플라보노이드, 아이소플라보노이드, 칼콘에 대하여 위치특이적 수산화 반응을 매개하는 P450을 스크리닝 하기 위하여 S. avermitilis와 N. farcinica 유래의 P450을 클로닝 하여 라이브러리를 구축하였고, 그 중에서 CYP105D7, CYP107Y1, CYP107P2, CYP125A2가 선택되었다. 이들 P450은 제니스테인 (4',5,7-trihydroxyisoflavone), 크리신 (5,7-dihydroxyisoflavone), 아피게닌 (4',5,7-dihydroxyisoflavone), 다이드제인 (4,7-dihydroxyisoflavone) 에 대하여 수산화 활성이 있다는 것이 규명되었다. P450 반응에 필요한 전자는 NAD(P)H로부터 공급되기 때문에, 효소 공정 시 조효소 공급을 위한 추가적인 비용이 불가피하다. 따라서, 비용 절감을 위해서는 whole cell 시스템의 도입이 필요하고 이를 위한 숙주개발이 필요하다. 본 연구는 S. avermitilis 내에 CYP105D7의 과발현을 유도함으로서 수산화 아이소 플라보노이드 생산성을 37 mg/L 로 증가시킬 수 있었다. 그러나 기질로 사용된 다이드제인과 그것의 수산화물이 S.avermitilis 내에서 분해되는 부반응이 있음을 보았고, 이는 S.avermitilis의 타이로시나아제가 관여됨을 알게 되었다. S.avermitilis내의 타이로시나아제를 제거한 돌연변이 주를 제작함으로써 부반응을 막을 수 있었지만 생산성이 낮아졌다. 이는 타이로시나아제가 제거된 돌연변이 주 내에서 Fdr, Fdx, CYP105D7의 발현양이 감소하기 때문이었고,이를 real time PCR 을 통하여 확인하였다. Ferredoxin (Fdx) 과 ferredoxin reductase (FDR)가 P450 반응의 전자 전달 단백질로서 그 중요도가 매우 높기 때문에, S. avermitilis 유래의 9개의 Fdx, 6개의 FDR 중 전자 전달에 관여되는 단백질 규명을 위한 연구가 필요하다. Fdr, Fdx의 mRNA 정량, FDR제거 돌연변이 주 제작, FDR, Fdx, P450의 in vitro 실험 등을 통하여 P450 반응에 필요한 전자는 NADPH로부터 FdrD, FdxH를 거쳐 최종적으로 CYP105D7으로 전달되는 것을 규명하였다.