Cloning and characterization of a recombinant gene for generation of CAR-iTreg harnessing CD40-CD154 interaction

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서울대학교 대학원
학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :의과대학 의과학과,2019. 8. 박정규.
서론: 조절 T 세포는 흉선에서 유래된 억제 능력을 가진 세포로 자
가항원에 대한 면역관용을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 본 연구
에서는 키메라 항원 수용체를 사용하여 CD40L 자극을 받으면 미감
작 T 세포를 조절 T 세포로 분화시키는 새로운 기술을 개발하였다.
키메라 항원 수용체는 세포 외 영역은 주로 항체에서 유래되고, 세
포 내 신호전달 영역은 T 세포의 신호전달 부분에서 유래된 합성
단백질이다. 키메라 항원 수용체의 세포내 영역에 TGF-β 수용체의
세포질 부분과 IL-2Rβ의 신호전달 영역 부분을 포함시켰다. 그 결과,
2 세대 키메라 항원 수용체를 기반으로 하여, MR1 단일 항체의 scFv
와 CD28, IL-2Rβ, TGF-βR1, CD3ζ의 부분을 클로닝을 통해 합성하였
고 CD40L 의 특이성을 가지는 키메라 항원 수용체를 제작하였다.

방법: 마우스 CD4+ T 세포는 MACS 시스템을 이용하여 분리하였다.
그리고 이 유전자들은 키메라 항원 수용체를 구성하는데 사용되었
다. 각 유전자들은 중합효소연쇄반응에 의해 특정 올리고뉴클레오티
드를 사용하여 증폭하고 연결시켜 재조합 유전자를 합성하였다. 합
성된 키메라 항원 수용체는 렌티바이러스 벡터에 삽입되었다. 이 벡
터와 운반벡터들을 사용하여, 키메라 항원 수용체를 암호화하는
DNA 를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 만들었으며, 수확된 바이
러스는 EL4 세포에 형질전환에 사용되었다.

결과: 키메라 항원 수용체 구조는 마우스 cDNA 로부터 얻은 후 합
성하였다. 완성된 키메라 항원 수용체는 렌티바이러스 벡터에 삽입
되었다. 그리고 키메라 항원수용체의 발현은 pLVX-IRES-ZsGreen1
벡터에 있는 ZsGreen 형광으로 확인하였다. 또한 키메라 항원 수용
체에 특이적으로 결합하는 CD40L 를 발현하는 세포주를 만들었고
mCherry 형광을 이용하여 발현을 확인하였다. 키메라 항원수용체를
발현하는 EL4 세포와 CD40L 를 발현하는 HEK293FT 세포를 함께
배양하고, 키메라 항원수용체를 발현하는 EL4 세포의 활성여부를
CD69 의 발현을 통해 확인하였다.

결론: 본 연구에서는 새로운 키메라 항원 수용체를 발현시킬 수 있
는 재조합 유전자를 합성하였는데, 기존의 수용체와 비교하였을 때,
IL-2Rβ와 TGF-βR1 의 세포내 영역을 포함한다는 점에서 특별하다.
IL-2Rβ와 TGF-βR1 의 세포내 영역은 항원 의존적으로 미감작 T 세
포가 조절 T 세포로 전환되는 것을 가능하게 한다. 이러한 키메라
항원수용체 구조가 이식 모델과 자가면역질환 모델에서 사용된다면,
유의미한 면역억제능력을 유도할 수 있을 것으로 기대한다. CD40L
특이성을 가지는 키메라 항원 수용체는 장기 이식후에 면역관용을
유도할 수 있는 새로운 전략을 제공할 수도 있을 것이다.
Introduction: The regulatory T cells (Treg) are thymus-derived suppressor
cells which play a critical role in maintaining immunological tolerance to self
antigens. Here, I describe a new approach to generating potent specific Tregs,
using a chimeric antigen receptor (CAR) targeting CD40L. CARs are fusion
proteins composed of an extracellular portion that is usually derived from
antibodies and intracellular signaling portion derived from T cell signaling
proteins. I generated a recombinant gene encoding a full length of the
cytoplasmic domain of CD28, IL-2Rβ, TGF-βR1, and CD3ζ fused with a scFv
of the MR1 mAb specific to CD40L as extracellular domain. Functionality of
the cloned CAR was confirmed in EL4 cells by stimulation with HEK293 cells
expressing CD40L.

Methods: Mouse CD4+ T cell was isolated by magnetic-activated cell sorting
(MACS) separation system according to the manufacturers instructions. And
this gene was used to compose the CAR construct. Each gene was obtained and
extended using specific oligonucleotides by PCR. The synthesized CAR
construct was inserted into a lentiviral expression vector. Using this vector and
packaging vectors, the CAR was transfected and resulted in the production of
lentivirus. The harvested virus was transduced in EL4 cell.

Results: The CAR construct was obtained and elongated from mouse cDNA.
And, synthesized CAR constructs cloned into a lentiviral expression vector. The
expression of CAR was confirmed by ZsGreen1 fluorescence in pLVX-IRES
ZsGreen1 vector. Also, the cell line expressing CD40L of antigen to CAR was
generated and confirmed by fluorescence of mCherry. The co-culture of EL4
cell expressing CAR on the response of HEK293FT cell expressing CD40L was
conducted. The activation of EL4 cells was examined by CD69 expression level.

Conclusions: I describe a unique strategy to generate CAR. This novel CAR
retains an identical costimulatory and CD3ζ signaling regions but also include
an intracellular domain of IL-2Rβ and TGF-β R1. The inclusion of the
intracellular domain of IL2-Rβ and TGF-βR1 enabled conversion of naïve T
cells to iTreg in an antigen-dependent manner. Therefore, I expect this CAR
construct would generate significant suppression effect in transplantation or
autoimmune disease model. This CAR with CD40L specificity might provide
a novel strategy to achieve tolerance in various immunopathologic conditions.
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