Visualization of NIR-fluorescence labeled Affibody and Trastuzumab in HER2 overexpressed Gastric CancerVisualization of NIR-fluorescence labeled Affibody and Trastuzumab in HER2 overexpressed Gastric Cancer

Abstract

배경: 영상을 기반으로 하는 진단과 수술은 광범위하게 사용되고 있는데, 그 중 근적외선 (NIR) 기반의 형광 이미징이 수술 중 혹은 내시경 중에 그 활용도가 매우 높다. 표적 항체와 작은 펩타이드를 이용하여 종양을 영상화 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며 이는 전임상 및 임상에서 적용되고 있다. 인체에 주입할 수 있는 형광물질인 indocyaninegreen(ICG)는 특이적으로 종양을 표지 할 수 없으며, 주입 후 금방 퍼지는 단점이 있다. 또한 ICG는 액체 상태에서는 매우 불안정 하며, 금방 퍼지기 때문에 주변 형광 신호가 함께 표지된다. 반면, 근적외선 형광 IRDye800CW는 ICG보다 수용성에서 훨씬 안정적이며 주변 비특이적 형광신호가 적게 보인다는 장점이 있다. HER2는 세포의 표면에 발현하고 있는 단백질로써 위암을 비롯한 많은 종류의 암에서 과발현시, 안 좋은 예후를 보인다. 특정 분자를 타겟하는 단백질 및 항체와 항체의 일부 조각들이 많이 발견되고 엔지니어링되었다. HER2에 특이적으로 부착할 수 있는 단백질 중 HER2의 서로 다른 위치에 붙는 antibody(trastuzumab)과 affibody를 이용한 연구가 활발히 되어있다. 목적 : 본 연구는 IRDye800CW와 HER2에 단일 항체 trastuzumab과 6-7kDa 정도의 사이즈인 affibody를 부착하여 HER2를 생체 내 정량 할 수 있는 도구로써의 분자 프로브를 개발하고 각각을 비교하며, 이를 소동물 근적외선 카메라와 실제 수술장에서 사용되고 있는 복강경 카메라를 사용하여 마우스 위종양모델에서 영상화하고 그 효용성을 확인하고자 한다. 방법: 본 연구팀에서는 HER2 발현 수준에 따라 인간 위암 세포주 NCI-N87, SNU601을 사용하여 실험을 진행하였다. HER2 단일 항체인 trastuzumab과 작은 단백질 구조를 가지고 있는 affibody를 근적외선 형광인 IRDye800에 합성하여 HER2 단백질에 부착하는 정도와 특성화도를 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 통하여 확인했다. 합성된 표적 프로브로 세포주를 형광 촬영하였으며 Trastuzumab-dye의 효용성을 보기 위하여 각 세포주는 암컷 BALB/c-nu 마우스 피하에 주입하여 2-3주간 종양 형성을 관찰하였고 부피가 200-300(mm3)에 이르렀을 때, 소동물 영상 장비인 IVIS와 복강경 카메라를 이용하여 형광을 영상화 하였다. Affibody-dye가 생체 내에서 HER2를 효과적으로 영상할 수 있는지를 보기 위하여 trastuzumab-dye 모델과 마찬가지로 각 세포주를 암컷 BALB/c-nu 피하에 주입 후 종양의 부피가 200-300(mm3)에 이르렀을 때, 소동물 영상장비로 형광을 확인하였다. Affibody-dye를 마우스에 주입 후 해당 물질이 종양에 도달하기까지 얼마의 시간이 필요한지 확인하기 위하여 HER2 양성 세포주 마우스모델에 affibody-In을 소동물 SPECT/CT를 이용하여 보았다. 형광 영상이 끝난 모든 마우스에서 종양과 다른 부위의 장기를 적출하여 포르말린에 고정시켜 파라핀 블록으로 만들어 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색과 면역조직화학염색법을 진행하여 암 조직의 HER2 발현과 분자적 특징을 확인하였다. 결과: 표면 플라즈몬 공명에서 합성된 trastuzumab-dye는 trastuzumab보다 높은 친화도를 보였으며, affibody-dye는 affibody보다 낮은 친화도를 보였다. Trastuzumab-dye를 각 HER2 양성 및 음성 세포주에 염색하였을 때, 둘 다 형광이 보이긴 하였으나 HER2 과발현 되어있는 NCI-N87에서 그 신호가 매우 셌음을 확인할 수 있었다. IVIS와 복강경 카메라를 이용한 trastuzumab-dye영상은 HER2 음성 위암 세포 마우스 모델에서보다 양성 위암 세포 마우스 모델의 종양에서 유의하게 높은 신호를 보였으며, HER2 음성 그룹에서는 신호 저해가 보이지 않거나 상당히 낮았다. 반면, affibody-dye 영상은 마우스 꼬리 정맥에 주사 후 약 30분 ~ 1시간 내에 신장으로 물질이 갔으며 이는 IVIS system에서 확인할 수 있었다. 체내 순환을 확인하기 위하여 affibody에 방사선 동위원소인 In를 부착하여 시간 별로 영상을 촬영해보았으나 신장으로 대부분의 형광이 갔음을 확인할 수 있었다. 결론: 본 연구를 통해 IRDye800CW와 결합 된 trastuzumab이 전임상적으로 과발현 되어있는 HER2 종양을 모니터링 할 수 있는 도구가 될 수 있음을 보였다. 크기가 매우 작은 affibody는 체내 순환이 빠르고 HER2 단백질에서 trastuzumab과 다른 위치에 부착한다는 이점을 바탕으로 전임상적인 효과가 뛰어날 것으로 예상하였지만 마우스에서는 그 효용성이 낮음을 확인하였다. 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 보이나 두 물질은 향후 위암 환자에서 조직검사를 하기 앞서 HER2 발현을 평가하기위한 보완적인 수단을 제공할 수 있을 것이다. 또한 이 물질은 영상 유도 수술 중 HER2 양성 병변을 추가로 탐지하는 데 활용될 수 있을 것이다.

Introduction: Human Epidermal Receptor-2(HER2) is highly overexpressed in many kinds of cancers with a poor prognosis. Recently, near-infrared (NIR) fluorescence-based imaging is a growing field for both pre-clinical and clinical application. We developed molecular probe for in vivo imaging of HER2 using prospective NIR fluorescence, IRDye800CW. This study aimed to image HER2 overexpression in gastric cancer. Methods: The human gastric carcinoma NCI-N87 and SNU601 and two patients-derived xenograft (PDX) cases were chosen by the level of HER2 expression. We obtained HER2-target probe under Click reaction. Trastuzumab (Roche, USA) and HER2-target affibody (Affibody AB, Sweden) were conjugated with IRDye800CW. The resulting conjugates were characterized by Reichart and Biacore affinity measurements. Female BALB/c nude (6 to 8 weeks old) mice were subcutaneously implanted with gastric cancer cell lines and PDX tissues. Fluorescence intensity was quantified by a Lumina II (Perkin Elmer) and laparoscopic NIR camera (InTheSmart, Seoul, Korea). Results: Trastuzumab-IRDye800CW showed higher affinity to HER2 (K(D) = 2.093(3)pM) than unlabeled trastuzumab(K(D) = 25.75pM). This probe showed significantly high signal in HER2 positive gastric cancer cell mouse tumor model, while no or low signal retention was observed in HER2 negative group. On the other hand, HER2-target affibody-IRDye800CW showed insufficient affinity (K(D) = 4.71 nM) compared to both unlabeled affibody(K(D) = 1.42 nM) and trastuzumab molecules. The renal clearance of HER2-target affibody conjugated with IRDye800CW was so fast that we could not detect the signal. Conclusion: Our results suggest that trastuzumab conjugated with IRDye800CW can be a feasible tool to monitor HER2 status in pre-clinical cancer imaging. Moreover, this probe can provide complementary means for assessment of HER2 expression in gastric cancer patients and/or be used to further detection of HER2-positive lesions during image-guided surgery.