A Study on the Expression of Voltage-gated L-type Calcium Channels in Adult Rat Odontoblast

Abstract

The primary role of odontoblasts is dentin formation that produces collagen-based mineralized tissue by the involvement of intracellular calcium signaling. There are many potential sources that increase intracellular calcium. Among these sources, strong candidate molecules involved in dentin formation are L-type calcium channels. It is a high-voltage activated family of voltage-dependent calcium channel, which is comprised of CaV 1.1, CaV 1.2, CaV 1.3, and CaV 1.4 isoforms. However, it has not been demonstrated how calcium signaling is mediated by L-type calcium channels in acutely isolated adult rat odontoblasts. In the present study, I initially hypothesized that the expression of L-type calcium channels mediates the calcium response by depolarization in acutely isolated rat odontoblasts. The molecular and functional expression of L-type calcium channels were examined through RT-PCR, single cell RT-PCR, and Fura-2-based ratiometric calcium imaging in odontoblasts. The intracellular calcium responses of the odontoblasts were observed by calcium imaging with combination of extracellular 50 mM KCl solution and the L-type calcium channels agonist, Bay K 8644, application. In contrast to TG neurons which showed significantly enhanced calcium transients by Bay K 8644 treatment, depolarization-induced calcium transients were unaltered by Bay K 8644 in odontoblasts. These results revealed that L-type calcium channels may not be functionally expressed in odontoblasts to mediate intracellular calcium signals in response to membrane depolarization in acutely isolated adult rat odontoblasts. Moreover, scRT-PCR further validated the results of the calcium imaging experiment, as mRNA of L-type calcium channel isoforms were not detected in odontoblasts. Thus, it is unlikely that L-type calcium channels mediate calcium signaling in adult rat odontoblasts.

상아모세포의 주요한 역할은 세포 내 칼슘 신호에 의해 형성되는 콜라겐 기반의 광화 조직인 상아질의 형성이다. 상아질 생성 과정 중 세포 내 칼슘 신호를 증가시키는 다양한 요인들이 보고되어 왔으며 그 중 주요한 요인 중 하나는 전압 의존성 L형 칼슘 통로의 활성이다. CaV 1.1, CaV 1.2, CaV 1.3, CaV 1.4 네 개의 동형 단백질로 구성되어 있는 전압 의존성 L형 칼슘 통로의 발현 및 기능은 현재까지 성체 쥐의 상아모세포에서 규명되지 않았다. 본 연구에서는 상아질 형성에서 세포 내 칼슘 신호 전달과 관련된 L형 칼슘 통로가 흰쥐 성체 쥐의 상아모세포에서 발현되어 있는지를 규명하고자 하였다. 그리고 이를 규명하기 위하여 RT-PCR, 단일 세포 RT-PCR 및 Fura-2를 기반으로 한 칼슘 이미징을 통해 상아모세포에 전압 의존성 L형 칼슘 통로의 발현 및 기능을 조사 하였다. 흰쥐 성체 상아모세포의 세포 내 칼슘 반응을 조절하기 위하여 고농도의 칼륨 용액으로 세포막 전위를 탈분극 시키면서 전압 의존성 L형 칼슘 통로의 작용제인 Bay K 8644 약물을 처리하였을 때, 세포 내 칼슘 신호가 증가되지 않는 것을 관찰하였다. 또한, 이 결과를 검증하기 위해서 단일 상아모세포의 전압 의존성 L형 칼슘 통로 mRNA 발현을 단일 세포 RT-PCR 기법을 통해 확인 하였을 때 L형 칼슘 통로의 동형 단백질인 CaV 1.1, CaV 1.2, CaV 1.3, CaV 1.4가 발현 되어있지 않은 것을 확인하였다. 추가적으로, 상아모세포에서 탈분극으로 인한 세포내 칼슘 신호 증가를 관찰하였기 때문에, 단일 세포 RT-PCR 기법을 사용하여 다른 전압 의존성 칼슘 통로의 발현을 탐색하였고, 그 결과 T형 칼슘 통로 중 하나인 CaV 3.1의 mRNA 발현을 확인하였다. 요약하여, 본 실험을 통하여 흰쥐 성체 상아모세포에서 전압 의존성 L형 칼슘 통로가 기능적으로 발현되지 않는다는 결과를 얻었으며, 흰쥐 성체 상아모세포에서 세포막 탈분극에 반응하는 칼슘 신호는 L형 칼슘 통로를 매개로 하는 것이 아닌 T형 칼슘통로, 특히 CaV 3.1을 매개로 할 가능성이 높으며 상아모세포 내 T형 칼슘통로의 역할을 규명하기 위한 후속연구가 필요하다.