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PDMS Sylgard 527-Based Freely Suspended Ultrathin Membranes Exhibiting Mechanical Characteristics of Vascular Basement Membranes

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Authors

Mitesh L. Rathod

Advisor
Lee, Junghoon
Issue Date
2019-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Mechanical Engineering
Description
학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :공과대학 기계항공공학부,2019. 8. Lee, Junghoon.
Abstract
In the past, significant effort has been made to develop ultrathin membranes exhibiting physiologically relevant mechanical properties, such as thickness and elasticity of native basement membranes. However, most of these fabricated membranes have a relatively high elastic modulus, ∼MPa−GPa, relevant only to retinal and epithelial basement membranes. Vascular basement membranes exhibiting relatively low elastic modulus, ∼kPa, on the contrary, have seldom been mimicked. Membranes demonstrating high compliance, with moduli ranging in ∼kPa along with sub-microscale thicknesses have rarely been reported, and would be ideal to mimic vascular basement membranes in vitro. To address this, we fabricate ultrathin membranes demonstrating the mechanistic features exhibited by their vascular biological counterparts. Salient features of the fabricated ultrathin membranes include free suspension, physiologically relevant thickness ∼sub-micrometers, relatively low modulus ∼kPa, and sufficiently large culture area ∼20 mm2. To fabricate such ultrathin membranes, undiluted PDMS Sylgard 527 was utilized as opposed to the conventional diluted polymer−solvent mixture approach. In addition, the necessity to have a sacrificial layer for releasing membranes from the underlying substrates was also eliminated in our approach. The novelty of our work lies in achieving the distinct combination of membranes having thickness in sub-micrometers and the associated elasticity in kilopascal using undiluted polymer, which past approaches with dilution have not been able to accomplish.
The ultrathin membranes with average thickness of 972 nm (thick) and 570 nm (thin) were estimated to have an elastic modulus of 45 and 214 kPa, respectively. Contact angle measurements revealed the ultrathin membranes exhibited hydrophobic characteristics in unpeeled state and transformed to hydrophilic behavior when freely suspended. Human umbilical vein endothelial cells were cultured on the polymeric ultrathin membranes, and the temporal cell response to change in local compliance of the membranes was studied by evaluating the cell spread area, density, percentage area coverage, and spread rate. After 24 h, single cells, pairs, and group of three to four cells were noticed on highly compliant thick membranes, having average thickness of 972 nm and modulus of 45 kPa. On the contrary, the cell monolayer was noted on the glass slide acting as a control. For the thin membranes featuring average thickness of 570 nm and modulus of 214 kPa, the cells tend to exhibit response similar to that on control with initiation of monolayer formation. Our results indicate, the local compliance, in turn, the membrane thickness governs the cell behavior and this can have vital implications during disease initiation and progression, wound healing, and cancer cell metastasis.
Next, we fabricated nanowrinkles on the ultrathin membranes to mimic the nanoscale topography of the vascular basement membranes. Conventional nano and microfabrication methods such as photolithograph, softlithography, embossing, printing and writing techniques fall short in developing structures with high fidelity when applied to PDMS Sylgard 527 due to its low modulus. To overcome this shortcoming, we develop an unconventional fabrication approach which utilizes PDMS sponge to generate nanoscale features on the ultrathin membranes. With our approach, nanowrinkles exhibiting amplitudes in the range of 38-210 nm and wavelengths in the range of 0.46-1 µm were developed on the freely suspended ultrathin membranes. Based on the underlying membrane thickness, the amplitudes and wavelengths of the generated nanowrinkles were noted to vary. The amplitude of the nanowrinkles was noticed to increase with an increase in membrane thickness. On contrary, the wrinkle wavelength was noted to reduce as the underlying membrane thickness increased. Nanowrinkles with large wavelength (1 µm) low amplitude (38 nm) were noted for thin membrane (570 nm) whereas thick membrane (8.6 µm) resulted in small wavelength (0.46 µm) high amplitude (210 nm)
nanowrinkles. Finally, we cultured human umbilical vein endothelial cells on the nanowrinkles to demonstrate the utility of our ultrathin membranes with nanoscale features as a cell culture substrate exhibiting the nanoscale biophysical environment of vascular basement membranes.
기저막의 두께, 탄성률 등은 생리학적으로 중요한 기계적인 특성으로 이러한 특성이 있는 초박막을 개발하기 위한 많은 노력이 있었다. 개발된 초박막 대부분은 수 MPa에서 수 GPa 수준의 고탄성 초박막으로 망막, 상피 조직의 연구에는 적합하지만, 혈관 기저막에 적합한 수 kPa 수준의 저탄성 초박막의 경우 개발된 사례를 찾아보기 어렵다. 높은 유연성과 수 kPa의 탄성력, 마이크론 이하의 두께를 보이는 인공 박막이 보고된 경우는 매우 드물지만 실현된다면 체외 혈관 기저막 모방에 유용할 것이다. 따라서 우리는 혈관의 기계적인 특성을 보이는 초박막을 제작하였다. 제작된 초박막의 핵심적인 요소는 자유지지형 구조, 생리학적으로 의미 있는 마이크론 이하의 두께, 수 kPa의 상대적으로 낮은 탄성률 및 세포 배양에 적합한 약 20㎟ 넓이이다. 초박막의 제작에는 폴리머와 용매를 희석하는 기존의 방식 대신 PDMS Sylgard 527를 희석하지 않은 방법을 사용하였고 희생층 없이도 박막을 기판에서 분리할 수 있었다. 본 연구는 마이크론 이하의 얇은 두께와 수 kPa의 탄성력을 지닌 초박막을 구현함으로써 폴리머를 희석하는 기존의 방식으로는 불가능하였던 특성을 구현하였다.
초박막의 평균 두께는 972 nm와 572 nm이고, 각각의 탄성계수는 45 kPa과 214 kPa으로 추정되었다. 접속각 측정을 통해 초박막은 기판에 붙어있는 상태에서는 소수성, 공중에 매달린 상태에서는 친수성을 보이는 것을 확인하였다. 박막의 부분적인 유연성 변화에 따른 세포의 반응을 조사하기 위해 인간 탯줄 정맥 내피세포를 폴리머 초박막에 배양한 후 세포 면적, 밀도, 덮인 면적비 및 확산율을 측정하였다. 배양 24시간 후, 높은 유연성의 두꺼운 막 (972 nm, 45 kPa) 위로 1-4개의 세포로 이루어진 그룹이 관찰되었다. 이와 반대로 슬라이드 글라스 위에 배양된 대조군에서는 단일세포층이 관찰되었으며, 얇은 막 (570 nm, 214 kPa) 에서도 대조군과 유사한 단일 층의 세포가 관찰되었다. 이 결과는 두께에 따른 박막의 부분적인 유연성이 세포의 행동에 영향을 미침을 보여주며, 이는 질병 개시 및 진행, 상처 회복과 암세포 전이에 있어 중요한 의의가 있다.
다음으로 초박막 표면에 나노주름을 제작하여 혈관 기저막의 표면적 특성을 나노 단위로 모사하였다. 기존의 포토리소그래피, 소프트리소그래피, 앰보싱, 프린팅, 라이팅 등의 나노마이크로공정 기술을 PDMS Sylgard 527처럼 낮은 모듈러스를 가지고 있는 물질에 적용하여 정확한 구조물을 제작하기에는 어려움이 있었다. 이러한 단점을 극복하기 위해 본 연구진은 PDMS 스펀지를 활용한 독특한 기법으로 초박막 위에 나노구조를 구현하였다. 이 방법으로 자유지지형 초박막 표면에 38-210 nm의 진폭과 0.46-1 µm의 파장을 가진 나노주름을 형성하였다. 박막의 두께에 따라 나노주름의 진폭과 파장이 각기 다르게 형성되었는데, 막의 두께가 증가할수록 나노주름의 진폭은 증가하고 파장은 감소하는 경향을 보였다. 얇은 막 (570 nm) 에서는 큰 파장 (1 µm) 과 작은 진폭 (38 nm) 의 나노주름이, 두꺼운 막 (8.6 µm) 에서는 작은 파장 (0.46 µm) 과 큰 진폭 (210 nm) 의 나노주름을 확인하였다. 마지막으로 나노주름 위에 인간 탯줄 정맥 내피세포를 배양하여, 초박막의 나노구조를 실제 혈관 기저막의 생물물리적 환경을 모사할 수 있는 배지로써의 활용성을 보였다.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/161909

http://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000156822
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