Modular Configuration of DEMETER DNA Demethylase and Its Application to Epigenome Editing

Abstract

DNA methylation is a key epigenetic modification which regulates gene expression and chromatin structure in higher eukaryotes. DNA methylation is often mitotically heritable but can be removed by active mechanisms in an enzyme-dependent manner. In Arabidopsis, the DEMETER (DME) DNA glycosylase specifically excises 5-methylcytosine (5mC), generating harmful 3′ blocking intermediates, which should be immediately processed by subsequent base excision repair machineries. DME and three other family members, REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1), DEMETER-LIKE 2 (DML2) and DML3 share similar domain structures, but display distinct catalytic efficiencies. The DME family proteins are large, multi-domain DNA glycosylases with variable sequences connecting conserved domains, but the contribution of these structures to the regulation of catalytic activity and the enzymes required for downstream demethylation pathway after 5mC excision are largely unknown. In this study, I extensively manipulated DME protein by reducing in size to identify the minimal regions necessary for 5mC excision activity. Domain swapping experiments revealed that the glycosylase domains of DME family members are functionally equivalent, and compatibility between conserved domains is critical for DNA demethylation in vitro. In addition, I demonstrated that ABASIC ENDONUCLEASE 1-LIKE (APE1L) and ABASIC ENDONUCLEASE-REDOX PROTEIN (ARP) are responsible for trimming unusual 3′ end structures after 5mC excision, which proposes more complete DNA demethylation pathway in plants. Finally, I applied DME to epigenome editing by fusion with a transcription activator-like effector (TALE) DNA binding module. TALE-DME fusion protein showed delicate modulation of DNA methylation at specified genomic loci. Taken together, these studies will broaden our understanding of the fundamental regulatory mechanism of DNA methylation and transcription, and provide a promising avenue to produce various epigenetic traits by targeted DNA demethylation.

DNA 메틸화는 중요한 후성유전학적 표지로, 고등생물에서 염색질의 구조와 유전자 발현을 조절한다. 일반적으로 DNA 메틸화는 세포 분열 이 후에도 유지가 되지만 필요한 경우 특정 효소에 의해 제거될 수 있고, 이를 DNA 탈메틸화라고 한다. 애기장대의 DEMETER (DME) DNA 글리코실라제는 DNA에 존재하는 5-메틸시토신(5mC) 염기를 특이적으로 인지하여 제거하고 생물체에 해로운 방해생성물을 만들어내는데, 이는 AP 엔도뉴클리아제 효소에 의해 안전하게 제거될 수 있다. 이 후, DNA 중합효소가 메틸기가 없는 시토신을 DNA에 넣어주게 되면 비로소 DNA 탈메틸화가 완성된다. DME 유전자군에 속하는 4개의 유전자인 DME, REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1), DEMETER-LIKE 2 (DML2) 그리고 DML3는 모두 비슷한 도메인 구조를 가졌지만, 서로 다른 5mC 제거 효율을 보인다. DME 유전자군에 속하는 단백질들은 크기가 크고 진화적으로 잘 보존된 여러 개의 도메인으로 이루어져 있으며, 이 도메인들은 변이가 많은 시퀀스를 통해 연결되어 있다. 하지만 이러한 구조적 특징이 DME의 효소 활성 조절에 미치는 영향이나, DME의 5mC 제거 반응 이후에 일어나는 DNA 탈메틸화 하위 경로에 대한 연구는 많이 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 DME 단백질의 크기를 극단적으로 줄여서 5mC 제거 활성에 필요한 최소한의 도메인을 탐색하고자 했고, DNA 탈메틸 효소의 모듈형 구성 개발에 성공하였다. 이 후, 도메인 치환 실험을 통해, DME 유전자군의 글리코실라제 도메인들이 모두 비슷한 잠재적 5mC 제거 능력을 가지고 있고, 도메인들 사이의 호환성이 DME의 효소 활성에 매우 중요하게 작용한다는 것을 밝혔다. 또한, 염기 절단 수리를 담당하는 애기장대 AP 엔도뉴클리아제에 속하는 ABASIC ENDONUCLEASE 1-LIKE (APE1L)과 ABASIC ENDONUCLEASE-REDOX PROTEIN (ARP)가 DME의 효소 활성 반응 이후 생성되는 비정상적인 방해생성물을 안전하게 제거할 수 있다는 것을 증명했고, 이를 통해 식물 내 DNA 탈메틸화 경로에 대한 더욱 완성된 모델을 제시할 수 있었다. 마지막으로 DME를 후성유전체 편집 기술에 응용하기 위해 DNA 부착 모듈인 transcription activator-like effector (TALE)와 융합하는 연구를 진행하였는데, 이 과정에서 만들어진 TALE-DME 융합 단백질은 원하는 유전체 부위에서 정교하게 DNA 메틸화를 조절하는 것을 확인할 수 있었다. 종합하면, 본 연구는 DNA 탈메틸 효소의 모듈형 구성을 개발하여 도메인 기능 연구와 DNA탈메틸화 경로 연구를 위한 기초지식을 제공하였고, 이를 후성유전체 편집 기술에 응용하여 농업적으로 유용한 다양한 후성유전학적 형질 창출에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.