Immune Responses to Stimulation of Brucella abortus Antigens

Abstract

Brucellosis caused by Brucella spp. and Brucella abortus has been known as a causative organism of zoonotic disease. B. abortus causes undulant fever, endocarditis, arthritis and osteomyelitis in man and abortion and infertility in cattle. It easily infects not only animals by ingestion or inhalation bacterium in reproductive tissues, fetal fluids, and mammary gland, but also a man by direct or indirect contact with abortion related discharges and ingestion of unpasteurized dairy products from the infected animals. B. abortus which invaded into the hosts through various pathways constructs autologous protection systems to avoid host cell immune system. In addition, the bacterium has been using various factors such as Brucella-containing vacuole (BCV), Type IV secretion system (T4SS), Cyclic β-1,2-glucan (cβG), Brucella-lipopolysaccharide (Br-LPS) to induce survival/replication of the organism in the host cells. Moreover, it interferes with the signaling pathways of phagocytic cells by regulation of the expression of cytokines in the immune cells of the host cells. A number of studies have been carried out for the prevention and eradication of brucellosis that allows such stealthy invasion and survival/replication. In particular, the mechanism of invasion into host cells and the analysis of immunological characteristics are actively investigated. Currently, efforts to detect early infection of B. abortus have been made. Cellular proteins of B. abortus have been received attention as diagnostic antigens through the studies. Based on current knowledge, cellular proteins as recombinant form were used to compare the expression of various genes, especially genes related with cytokines by stimulation of immune cells derived from different host. Also, this study attempted to generate basic information on the development of new diagnostic method(s) and vaccine candidate in B. abortus infection. First, the expressions of IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12p40, IFN-γ, TNF-α and iNOS were analyzed in bovine peripheral blood mononuclear cells. Also, the expression of Bax, Bcl-2 and TLR4 was analyzed after stimulation with B. abortus antigens (rMdh, rOMP28, rRocF, rTsf and r0628). Each B. abortus antigens induced different patterns of cytokine expression depending on stimulation time and doses of antigens. Although IL-1β, IL-4, TNF-α and iNOS gene expressions were not observed, the expressions of IL-6, IL-12p40 and IFN-γ were induced in all stimulated B. abortus antigens (P < 0.05). The expression of apoptotic genes was not changed except TLR4 (P < 0.05). Second, RAW 264.7 cells, a mouse macrophage cell-line, and mice were stimulated with B. abortus antigens (rMdh, rOMP10, rOMP19, rOMP28, rRocF and rTsf) to confirm the difference of immune responses in in vitro and in vivo. Changes in cytokine production were examined by stimulating with the cellular proteins in both RAW 264.7 cells and naive splenocytes. The immune response was analyzed by ELISA and ELISpot after immunization of mice with the B. abortus antigens (rMdh, rOMP10, rOMP19, rOMP28, rRocF and rTsf). The production of cytokines such as TNF-α and IL-6 was increased in stimulated RAW 264.7 cells (P < 0.05) while Th1-related cytokines, IFN-γ and IL-2, were induced in naive splenocytes (P < 0.01). In addition, the immune responses induced by the B. abortus antigens were compared by analyzing the in vivo immune response through the difference of IgG secretory cells. As a result, IgG production on the 28th day was significantly increased by immunization with those antigens (P < 0.05). Last, it was studied that the difference in immune responses generated by stimulated with B. abortus antigens (rMdh, rOMP10, rOMP19, rRocF and rTbpA) in THP-1 cells, human-derived leukemic monocytes. In particular, it was investigated to focus on the expression of major immune-regulating factors that play important roles in innate immunity, such as cytokines and Toll-like receptors (TLRs), and acquired immunity in the host. After stimulation of THP-1 cells with B. abortus antigens, intracellular cytokine production and TLR expression were increased at different time points (12 and 24 h), and the differences were analyzed by quantified using ELISA and real-time RT-PCR, respectively (P < 0.05). In the expression of cytokines, it was observed that the production levels of TNF-α and IL-6 were induced at high levels in THP-1 cells stimulated with B. abortus antigens (P < 0.05). In addition, expression of TLR8 was significantly increased at 12 h after stimulation with rOMP19 and rMdh (P < 0.05). These results suggest the need for further studies on how the two B. abortus antigens, rOMP19 and rMdh, are involved in the expression of TLR8 within THP-1 cells. The results of these studies with immune cells derived from different hosts using the B. abortus antigens (rMdh, rTsf, rRocF, r0628, rTbpA, rOMP10, rOMP19 and rOMP28) showed that many of B. abortus cellular antigens showed higher antigenicity in different hosts. It indicated that rMdh and rOMP19 of these B. abortus antigens exhibits higher immunogenicity than other antigens. In particular, rMdh showed the highest immunogenicity to all immune cells used in this study. This study demonstrated the possibility of B. abortus antigen as an intracellular immune response modulator as well as a candidate for high immunogenicity antigens. Therefore, these findings would be useful for understanding basic immune responses, development of diagnostic method and vaccine candidate in B. abortus infection in the future.

브루셀라증은 브루셀라 속균감염에 의해 지속적으로 발생되고 있는 주요한 인수공통전염병 중 하나이다. 특히, Brucella abortus는 소에서 유•사산, 불임등의 번식장애를 사람에서는 파상열, 심내막염, 관절염, 및 골수염을 유발한다. 이러한 B. abortus는 유•사산된 태아, 태반, 양수 및 감염동물의 유선을 통해서 배출된다. B. abortus의 감염은 유•사산물과의 직•간접적인 접촉 또는 멸균되지 않은 유제품의 섭취등에 의해서 이루어질 수 있다. 다양한 경로를 통하여 숙수세포에 침투한 B. abortus는 숙주세포의 면역기전을 회피하기 위한 자가보호시스템을 구축하고 있으며, Brucella-containing vacuole (BCV), Type Ⅳ secretion system (T4SS), Cyclic β-1,2-glucan (cβG), Brucella lipopolysaccharide (Br-LPS)등의 여러가지 요소들을 이용하여 세포내에서의 생존/복제가 가능하다. 또한, 숙주세포에서 면역반응으로 발현되는 사이토카인의 발현을 조절하기 위하여 다양한 대식세포들의 신호전달체계를 방해한다. 이러한 세포내 침입과 생존/복제가 가능한 브루셀라의 예방 및 근절을 위하여 많은 연구가 진행되었다. 특히, 숙주세포 침입기전 분석 및 면역학적 특성 분석에 관한 연구에 많이 집중되었다. 현재 브루셀라의 초기 감염을 진단하기 위한 노력은 지속되고 있으며 B. abortus 감염시 강력한 면역반응을 유발시키는 B. abortus 항원들이 진단항원으로써 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 이러한 B. abortus 세포 항원들을 서로 다른 동물유래의 면역세포에서 면역유도능력을 사이토카인과 면역관련 유전자의 발현차이로 비교하여, B. abortus 감염증 예방을 위해 발병기전, 최적의 진단법 및 백신항원후보물질 발굴을 위한 기초 자료를 제공하고자 하였다. 첫번째로, 소의 말초혈액단핵세포(PBMC)의 면역반응 양상을 알아보고자 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12p40, IFN-γ, TNF-α 및 iNOS의 발현을 확인하였다. 또한, 세가지 세포사멸 관련 유전자인 Bax, Bcl-2 및 TLR4의 발현을 B. abortus 항원(rMdh, rOMP28, rRocF, rTsf and r0628) 자극에 의한 면역세포의 반응을 통하여 분석하였다. 각 B. abortus 항원은 자극 시간 및 투여량에 따라 사이토카인 발현양상은 상이하게 나타났다. 즉, IL-1β, IL-4, TNF-α 및 iNOS 유전자 발현은 관찰되지 않았지만, IL-6, IL-12p40 및 IFN-γ의 발현은 모든 B. abortus 항원 자극으로 유도되었다(P < 0.05). 세포사멸 관련 유전자의 발현은 TLR4 외에 변화가 없었다(P < 0.05). 두번째로, 마우스 유래의 면역세포인 RAW 264.7 세포 및 마우스에 B. abortus 항원(rMdh, rOMP10, rOMP19, rOMP28, rRocF and rTsf)을 자극하여 면역반응의 차이를 분석하였다. 사이토카인 발현은 B. abortus 항원으로 RAW 264.7 세포와 비장세포를 자극시킨 후 조사하였다. 면역 반응은 B. abortus 항원(rMdh, rOMP10, rOMP19, rOMP28, rRocF and rTsf)으로 마우스를 면역시킨 후 ELISA 및 ELISpot을 통하여 비교분석하였다. 자극된 RAW 264.7 세포에서는 TNF-α와 IL-6 발현이 증가하였고(P < 0.05), 비장세포에서는 Th1 관련 사이토카인 IFN-γ와 IL-2가 유도되었다(P < 0.01). 또한, 마우스 면역에 따른 생체내 면역반응을 IgG 분비 세포의 발현 차이를 분석함으로 B. abortus 항원에 따라 유도되는 면역반응을 비교한 결과 면역 후 28일째 IgG의 발현이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(P < 0.05). 마지막으로, 사람유래 면역세포인 THP-1 세포를 B. abortus 항원(rMdh, rOMP10, rOMP19, rRocF and rTbpA)으로 자극하여 발생하는 면역반응의 차이를 확인하였다. 특히, 사이토카인과 Toll-like receptors (TLRs) 같은 선천성 면역을 조절하고, 감염 후 숙주가 면역을 획득하는데 중요한 역할을 하는 주요 조절인자들의 발현차이에 초점을 맞추어 진행하였다. B. abortus 항원으로 THP-1 세포를 자극 시킨 후, ELISA 및 real-time RT-PCR을 사용하여 사이토카인 생성 및 TLR 발현량을 두시점(12 및 24시간)에서 정량, 비교분석하였다. 사이토카인 생성에 있어서, B. abortus 항원으로 자극된 THP-1 세포에서 TNF-α 및 IL-6의 발현량이 높게 유도되었다(P < 0.05). 또한, TLR8은 rOMP19 및 rMdh로 자극 후 12시간에 대조군에 비해 유의한 발현증가를 나타냈다. 이러한 결과는 두 개의 B. abortus 항원인 rOMP19와 rMdh가 THP-1 세포에서의 TLR8 발현유도에 관한 추가 연구의 필요성을 시사한다. B. abortus 항원(rMdh, rOMP10, rOMP19, rOMP28, rRocF, rTbpA, rTsf and r0628)을 이용한 서로 다른 동물유래 면역세포들의 면역반응 연구결과를 종합하면, 본 연구에 사용된 B. abortus 항원들 중 고면역원성을 나타내는 수종의 B. abortus 세포 항원이 확인되었다. 이들 B. abortus 항원 중 rMdh와 rOMP19는 높은 면역원성을 나타내었다. 특히, rMdh는 본 연구에서 사용한 모든 동물유래 면역세포에 대해 고면역원성을 보였다. 본 연구를 통하여 B. abortus 항원의 세포내 면역반응 조절인자로서의 활성뿐 아니라 고면역원성 항원 후보물질로서의 가능성을 확인할 수 있었으며, 이러한 연구결과는 향후 B. abortus 감염증 예방을 위한 진단법 개발 및 백신후보물질 발굴을 위한 기초자료로 유용할 것으로 사료된다.