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Characterization of chemical constituents from Sicyos angulatus and Ambrosia artemisiifolia using molecular networking and mass defect filtering

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Authors
안진표
Advisor
오원근
Issue Date
2019-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Sicyos angulatusmolecular networkingNAFLDAmbrosia artemisiifoliamass defect filteringneuroprotection
Description
학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :약학대학 약학과,2019. 8. 오원근.
Abstract
Part 1
가시박 (Sicyos angulatus L.)는 박과 (Cucurbitaceae) 식물로써 북미가 원산인 1년생 덩굴식물이다. 가시박은 burcumber, one-seeded burcucumer, star-burcucumer 등의 영문명 또는 안동오이라는 한글명으로 불리운다. 가시박은 6~9월에 개화하며 3개에서 10개의 열매가 뭉쳐서 나는데 가시가 위협적이고 날카롭다. 주로 강변에 많이 분포하나 장소를 가리지 않고 번식하여 주위 생태계를 교란시켜 환경부 지정 생태계교란 야생식물로 분류되지만 잎과 열매는 식품으로 지정되어 그 효과나 성분이 확인될 경우 건강기능식품으로서의 발전가능성이 있는 식물이다. 본 식물에서는 flavonoids glycoside, steroid 등이 분리 보고된 2편의 논문이 있으며, 최근 본 연구팀에 의하여 가시박 70% 에탄올 추출물의 간경화 효과가 규명되었다. 가시박에 관하여 많은 연구가 보고되었지만 대부분이 생육, 생태에 관한 연구들이며 화학성분이나 생리활성에 관한 연구는 많지 않은 실정이다.
본 연구팀은 식물 추출 라이브러리 은행에서 선정된 식물 추출물 300개를 대상으로 간지방 억제 활성 스크리닝 시험을 진행하였으며 그 결과 가시박 추출물이 유의미한 효과를 나타내었으며 이에 단일 화합물을 분리 및 동정하였으며 활성 평가를 시험하였다.
비알콜성 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD)는 지방간, 비알콜성 지방간염, 섬유화증 및 간경변을 포함한다. 간세포 내에 중성지질 함량이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 상태를 말하며 인슐린 저항성 및 간 내 염증 반응을 유도하여 지방간염을 유도하기도 한다. 비알콜성 지방간이나 지방간염이 있는 환자의 20-40%가 결과적으로 섬유증이나 간경변을 가지게 된다고 보고된다. 또한 비만 인구가 증가함에 따라 점차 유병률이 증가하고 있으며 간기능 장애의 가장 흔한 원인이다. 비알콜성 지방간은 대사증후군과도 관련되는데 이는 탄수화물의 대사에 있어서 간이 중요한 역할을 하기 때문이다. 간은 글리코겐합성과 글리코겐분해를 통하여 혈당을 안정적으로 유지시키는데 간의 대사에 이상이 생길 시 혈당 조절이 실패하게 되며 이는 대사증후군을 일으키는 요인이 된다. 간경변을 가진 환자의 약 96%가 당내성을 가지며 30%의 환자는 당뇨를 가진다고 보고된다.
가시박 70% 에탄올 추출물은 그 구성성분이 분자네트워크 (molecular network)을 통하여 비슷한 화학적 구조별로 클러스터를 생성하였으며 GNPS 라이브러리를 통하여 화학적 구조가 제시되었다. 분자네트워크 (molecular network) 방법은 수 많은 분자간 조각이온 패턴의 유사도를 확인함으로써 그 유사성의 정도에 따라 서로 다른 그룹으로 구분 한다. 추출물 혹은 분획물의 샘플은 고해상도 질량분석기를 통하여 극성별로 피크가 나뉘어 지며 이때 각각의 피크는 조각이온 정보를 가지게 된다. 그 후 MZmine등의 프로그램을 통하여 이 정보들이 보정되며 재가공된 정보는 GNPS 라이브러리 (https://gnps.ucsd.edu/) 를 통하여 유사한 화학적 구조별로 cluster를 형성하며 각각의 화학구조 또한 제시 된다. 그 결과 가시박의 flavonoid 배당체 그룹은 크게 두개의 소그룹으로 구분 되었으며, 그 중 하나의 소그룹은 flavonoid를 비배당체로 하여 당이 연결된 구조를 가지며 다른 하나의 소그룹은 flavonoid를 비배당체로 하여 당과 cinnamoyl 모획을 포함하는 구조인 것이 확인되었다.
가시박 추출물은 총 추출물 및 n-hexane, Ethyl acetate, n-BuOH 등으로 나뉘었으며 활성이 가장 좋은 Ethyl acetate 분획을 순상 및 역상 컬럼크로마토그래피, HPLC 등을 을 이용하여 단일화홥물을 분리하였다. 총 13종의 화합물을 분리하였으며 이 중 kaempferol 3-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (1), kaempferol 3-O-β-D-apiofuranosyl-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside (8), quercetin 3-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (9), kaempferol 3-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside (11), kaempferol 3-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside (12), tricin 4-O-(7R,8R-guaiacylglyceryl)ether-7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside (13)의 6종의 신규화합물을 분리할 수 있었다. 화합물 13의 경우 flavonolignan glycoside로써 ECD 계산을 통하여 입체구조가 결정되었다.
분리된 13종의 화합물을 대상으로 간세포에서의 지방축적감소 효과를 확인하고자 하였다. 글루코스, 유리지방산, 인슐린을 처치하여 인슐린 저항성이 유도된 HepG2 세포에 13종의 화합물 각각을 처치하였으며 감소된 중성지방의 양은 형광키트 (Cell Biolabs, Inc, CA, USA)를 통하여 확인되었다. 중정지방 억제 활성을 평가한 결과 화합물 (1-4, 6, 11-13)에서 모두 억제활성이 확인되었고 그 중 화합물 4번이 가장 뛰어난 활성을 보였다. 또한 화합물 1, 3, 4 과 13번은 10, 20, 40 µM에서 농도의존적으로 지방의 양을 감소 시킴이 확인되었다. 화합물 3번과 4번은 정량 시험 결과 각각 추출물 대비 15.35 ± 0.01 mg/g, 1.35 ± 0.01 mg/g의 양을 가지는 것으로 확인되었다.
구조적 특징에 따른 활성을 살펴보면, 분리된 화합물 중 cinnamoyl 작용기를 가지는 kaempferol 3-O-β-D-glucoside 유도체의 경우 모두 간 중성지방의 억제효과를 보였고 이는 기존 연구 결과들과 일치하였다. 또한 화합물 13번의 경우 간보호 효과로 널리 알려진 실리마린의 성분들과 유사한 구조를 가지고 있다.
본 연구는 가시박 70% 에탄올 추출물과 이로부터 분리된 단일 화합물이 지방간 감소에 효과가 있다는 것을 제시하였다.

Part 2
돼지풀 (Ambrosia artemisiifolia L)은 국화과 (Asteraceae) 식물로써 북미가 원산인 1년생 초본 식물이다. 돼지풀이란 이름은 영국의 hogweed에서 유래하였으며 들이나 밭에 자라는 특징을 가진다. 또한 돼지풀은 가시박과 함께 대표적인 생태계 교란식물로써 높은 번식력과 타 식물과의 경쟁에서 우위를 점하는 특성으로 인해 전국에 걸쳐 분포하는 잡초이다. 전체에 굳센 털이 많으며 가지가 많이 갈라지고 줄기는 1.5m 까지 곧추서며 8-9월에 개화한다. 단풍잎돼지풀과 달리 잎이 손바닥 모양이 아닌 깃꼴로 갈라진다. 돼지풀에서는 sesquiterpene, triterpene과 caffeic acid 유사체가 분리, 동정되었으며 항산화효과 항균효과등이 보고되어 있다.
본 연구팀은 식물 추출 라이브러리 은행에서 선정된 식물 추출물 300개를 대상으로 뇌 신경보호 활성 스크리닝 시험을 진행하였으며 그 결과 돼지풀 추출물이 유의미한 활성 효과를 나타내어 추가적으로 추출물 중 활성분획에 관한 화합물 분리, 동정을 진행하였다.
알츠하이머 질환에서는 대뇌피질 속 신경세포의 손실로 인하여 뇌회의 위축이 발생하며 신경반과 신경원섬유농축을 보이는 특징을 가진다. 신경반은 독성물질인 베타아밀로이드(Aβ)가 응결되어 뇌신경세포를 둘러싸며 그 주변을 염증 세포가 둘러싸고 있는 형태를 나타낸다. 이는 강한 신경 독성을 유발하여 세포 사멸을 일으키고 신경퇴행을 유도하여 알츠하이머질환을 유발한다. 현재 전세계적으로 약 3천만명의 인구가 알츠하이머 병으로 고통받고 있으며 세계보건기구 (WHO)는 향후 20년간 이 숫자가 3배 증가할 것이라 예측하고 있다.
질량결손필터링 (mass defect filtering)은 2차 대사산물의 종류별로 기본골격을 이루는 수소, 산소, 질소 등의 원자의 비율이 다름을 이용하여 표적하는 특정 종류의 생리활성 물질을 분류하는데 정보를 제공한다. 탄소의 경우 12.0000의 원자량을 가지며 수소, 산소의 경우에는 각각 1.0078, 15.9949의 값을 가지게 되므로 수소 대비 산소의 비율이 높아질수록 낮은 질량결손 값을 가지며 이와 같은 원리를 이용해 표적 물질을 분류할 수 있다. 본 연구를 진행하는 중 eudesmane 배당체가 뇌신경 보호에 활성을 나타내는 것이 확인되었으며 또한 HMG (3′′-hydroxy-3′′-methylglutaryl) 기가 존재하는 eudesmane 배당체 혹은 2개 이상의 당분자를 포함한 eudesmane의 경우 신규화합물로 판별되었기에 질량결손필터링을 통하여 eudesmane 배당체 혹은 HMG 기를 포함하는 eudesmane 배당체를 분리 및 동정하였다. 또한 질량결손필터링을 하는 과정에서 이를 보완하는 방법으로 분획물단계에서의 NMR 스크리닝을 실시하였다. Silicagel를 통하여 극성별로 5개의 분획을 얻은 다음 Sephadex-LH20 컬럼을 이용하여 5개분획 각각에 대하여 페놀성화합물과 terpene을 구분 하였다. 각각의 terpene분획을 1H-NMR로 스크리닝하여 HMG 에서 특징적으로 나타나는 메틸렌 프로톤의 존재를 확인하였다.
돼지풀 추출물은 총 추출물 및, n-hexane, Ethyl acetate, n-BuOH 등으로 나뉘었으며 활성이 가장 뛰어난 Ethyl acetate 분획을 순상 및 역상 컬럼크로마토그래피, Sephadex-LH20, HPLC 등을 이용하여 단일화합물을 분리하였다. 총 14종의 (1-14) 화합물이 분리되었으며 eudesmane 배당체 (1-8), sesquiterpene lactone (11-12), spermidine (13-14)로 분류된다. 이 중 eudesmane 배당체인 1α,6β,9β-trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-3-ene-9-O-[(S)-3′′-hydroxy-3′′-methylglutaryl]-6-O-β-D-glucopyranoside (1), 1α,6β,9β-trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-3-ene-1-O-[(S)-3′′-hydroxy-3′′-methylglutaryl]-6-O-β-D-glucopyranoside (2), 1β,6α-dihydroxy-7-epi-eudesm-3-ene-1-O-[(S)-3′′-hydroxy-3′′-methylglutaryl]-6-O-β-D-glucopyranoside (3), 1α,6β,9β-trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-3-ene-9-O-[(S)-3′′-hydroxy-3′′-methylglutaryl]-6-O-(6′-O-acetyl)-β-D-glucopyranoside (4), 1α,6β,9β-trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-3-ene-1-O-α-L-arabinopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside (5), 1α,6β,9β-trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-3-ene-6-O-β-D-glucopyranoside (6), 1β,6α-dihydroxy-7-epi-eudesm-3-ene-6-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (7)의 7종의 신규화합물을 분리하였다. 화합물 1-4의 경우 ECD 계산을 통하여 비당체의 절대구조를 정하였으며 화합물 1의 HMG의 경우 기존의 연구결과를 참고하여 amination, reduction, acetylation등의 과정을 거쳐 절대구조를 결정하였다. 가수분해 과정을 통하여 화합물 1에서 HMG를 제거하였으며 이 화합물은 13C-NMR, HPLC 등을 통하여 화합물 6과 동일함을 확인하여 화합물 6의 절대 구조를 규명하였다. 화합물 5번과 7번의 경우도 동일하게 가수분해를 통하여 특정 당이 제거되었으며 이는 각각 HMG기가 제거된 1번과 3번과 동일한 반응생성물임을 확인함으로써 절대구조를 결정하였다.
분리된 14종의 화합물을 대상으로 뇌신경보호 효과를 확인하고자 하였다. pEGFP-C1/Aβ 42 플라스미드를 Lipofectamine 2000 regent와 함께 HT-22 cell로 도입하여 10 시간 반응시킨 후 14종의 화합물을 각각 처치하여 화합물의 세포보호 효과를 관찰하였다. 화합물 1, 2, 4-6, 8-9, 11 그리고 13-14번 화합물에서 뇌신경 보호효과가 나타났으며 화합물 5번과 6번은 10, 20, 40µM 에서 농도의존적으로 효과를 보였다.
본 연구는 돼지풀 70% 에탄올 추출물과 이로부터 분리된 단일 화합물이 뇌신경보호에 효과가 있다는 것을 제시하였다.
주요어: 가시박, 돼지풀, molecular networking, mass defect filtering, 비알콜성 지방간, 뇌신경보호.
학번: 2014-31251.
Part 1
A library of extracted natural materials (Korea Bioactive Natural Material Bank) have been screened to discover candidates for the treatment of non-alcoholic liver disease (NAFLD), and the 70% ethanol extract of Sicyos angulatus was found to inhibit hepatic lipid accumulation. Bioassay–guided fractionation of this bioactive extract yielded five previously undescribed flavonoid glycosides (1, 8, 9, 11, and 12) and one previously undescribed flavonolignan glycoside (13) along with seven known flavonoid glycosides (2-7, and 10). The chemical structures of these compounds were elucidated by a combination of extensive spectroscopic analysis, including MS, NMR, and UV techniques. Compounds 1-4, 6, and 11-13 showed inhibitory effects on the lipid accumulation induced by high concentrations of palmitic acid and glucose in HepG2 cells. Four selected compounds (1, 3, 4, and 13) were tested for lipid content in a dose-dependent manner (10, 20, and 40 μM), and among those compounds, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (4) showed the strongest inhibition of hepatic lipid production in HepG2 cells. In an oil-red O staining assay, five compounds (1, 3, 4, 11, and 13) were shown to reduce hepatic lipid accumulation better than what was observed in the vehicle control group. The present study suggests a new class of chemical entities for developing bioactive agents for the treatment of diseases caused by fat accumulation in the liver.

Part 2
In Alzheimers disease (AD), amyloid-β (Aβ) accumulation in the brain results in neuronal cell death and is one of the major causes of dementia. Since the current therapeutic agents are not yet sufficiently effective or safe, there have been attempts to find new neuroprotective chemicals against Aβ-induced cytotoxicity. A 70% EtOH extract of the whole plants of Ambroisa artemisiifolia (common ragweed) was selected after the screening of a natural extract library. Seven new eudesmane-type glycosides (1-7) and seven known compounds (8-14) were obtained through bioactivity-guided fractionation from the aerial parts of this plant. Their structures were determined on the basis of their NMR spectra, HRESIMS analysis, and ECD calculations. Among them, compounds 1, 2, 4-6, 8-9, 11, and 13-14 showed protective effects against Aβ-induced cytotoxicity in Aβ42-transfected HT22 cells. The most active compounds, 5 and 6, exhibited moderate protective activity dose-dependently (10, 20, and 40 µM).
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/162215

http://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000157627
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