The roles of hepatic nuclear receptor RORα in mitochondrial dynamics and autophagy

Abstract

비알콜성 지방간염 질환은 과도한 식이 섭취, 약물, 유전자적 원인으로 인하여 발생하는 대사성 질환으로 비만, 고지질혈증, 당뇨 등의 질환과 연관이 깊다. 비알콜성 지방간염은 지질 축적이 일어난 지방간의 상태에서 세포 손상, 염증이 동반되어 진행된 질환이다. 산화 스트레스, 지질 독성, 세포 사멸로 인한 분자적 매개체로 인해 일어나는데 이들 현상은 모두 미토콘드리아의 기능 손상에 의해 일어난다. 실제로 비알콜성 지방간염 질환을 가진 환자들의 간 내 미토콘드리아는 구조적 이상 및 기능적 이상을 나타내는 것이 알려져 있다. 미토콘드리아의 기능은 분열, 생합성, 미토콘드리아-특이적 자가포식이라는 다양한 작용을 통해 조절된다. 비알콜성 지방간염 발병에서의 미토콘드리아 기능조절인자를 밝히고 분자적 기전을 밝힌다면 해당 질환을 치료하는데 기여할 수 있다. 그러나 비알콜성 간염 질환을 치료하는 약물은 부재한 실정이며 현재 임상시험 중인 약물들은 미토콘드리아 기능 상실이라는 병인을 직접적으로 제거하기보다 비알콜성 지방간염에 의해 수반되는 병적 현상을 호전시키는 것에 무게를 두고 있고 이와 더불어 고지질혈증을 유발하는 등의 부작용 또한 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 비알콜성 지방간염 치료에 있어서 미토콘드리아 기능을 직접 조절하는 인자를 발굴하고자 하며 후보 인자로서 핵 수용체 RORα을 제시하는 바이다. 구체적으로는 간세포 내 미토콘드리아 분열 및 자가포식 작용을 조절하는 분자적 기전을 규명함으로써 RORα를 비알콜성 지방간염 질환의 치료인자로 제시하고자 한다. 먼저 비알콜성 지방간염 질환에서의 RORα의 역할을 규명하고자 간세포 특이적 RORα 결손(RORα-LKO) 마우스를 제작하였고 고지질 식이를 12주간 수행하였을 때 비알콜성 지방간염이 발생한 것을 확인하였다. RORα-LKO 마우스의 간 조직 내 지질 축적과 간 손상 지표가 증가하였고 지질 과산화 및 염증 인자의 발현이 증가한 것을 관찰하였다. 또한 RORα-LKO의 간 조직 내 콜라겐 축적이 증가하였으며 섬유화 관련 인자의 단백질 발현이 증가하였다. 이상의 결과를 통해 RORα-LKO 마우스는 비알콜성 지방간염이 발병하기 쉽다는 것을 알 수 있었다. RORα-LKO 마우스에서 비알콜성 지방간염 병증이 심화된 이유를 전사체 분석을 통해 미토콘드리아 기능 손상에서 찾을 수 있었고, 실제 간 조직 내 미토콘드리아 구성 단백질의 발현과 기능이 RORα-LKO 마우스에서 감소되어 있었다. 전자현미경 분석 결과 RORα-LKO 마우스의 간 내 미토콘드리아가 구조적 이상을 갖거나 비정상적으로 커져 있는 것을 확인하였다. RORα-LKO 마우스에서 일차 배양 간세포를 분리한 후 미토콘드리아 기능의 지표 중 하나인 산소 소비량을 측정하였을 때 대조군에 비하여 감소되어 있음을 확인하였다. 또한 지방산 처리를 하여 미토콘드리아 분열을 유도하였을 때 대조군과 달리 RORα-LKO 마우스의 간세포에서는 분열이 일어나지 않았고 모양도 부풀어있는 등 비정상적인 형태였다. 분자적 기전을 규명하기 위하여 미토콘드리아 분열과 관련된 인자들의 단백질 발현을 확인한 결과, RORα-LKO 마우스의 간세포에서 Bnip3와 Drp1의 인산화가 감소되어 있는 것을 확인하였다. 다음으로, 자가포식 작용이 RORα에 의하여 조절될 수 있는지를 확인하였다. RORα-LKO 마우스의 간 조직 내 오토파고좀(autophagosome)이 감소되어 있는 것을 전자현미경 분석을 통해 확인하였다. p62, LC3-Ⅱ, NBR1의 단백질 축적 현상을 통해 자가포식능이 RORα-LKO 마우스에 감소된 것을 알 수 있었다. RORα-LKO 마우스에서 일차 배양 간세포를 분리하고 바필로마이신(bafilomycin) 약물 처리를 통한 LC3-Ⅱ의 축적을 통해 자가포식능을 확인한 결과 RORα 결손으로 인하여 감소되어 있었다. 선택적 자가포식 작용 중에서 미토콘드리아 기능 조절과 관련된 미토콘드리아-선택적 자가포식능을 확인했을 때 RORα-LKO 마우스의 간 내 미토파고좀(mitophagosome)의 형성이 줄어들어 있었다. 일차 배양 간세포를 분리하고 지방산 처리를 통해 미토콘드리아-선택적 자가포식 현상을 유도하였을 때 RORα-LKO에 의하여 미토콘드리아-선택적 자가포식 작용이 억제되어 있었다. 또한 리소좀에 의한 미토콘드리아의 분해 현상이 RORα 결손에 의해 줄어들었다. 손상된 미토콘드리아의 분해와 함께 자가포식 작용을 통한 지질 분해 현상이 비알콜성 지방간염 완화에 도움을 주는 바, RORα-LKO 마우스에서 지질-특이적 자가포식 작용이 변화되어 있는지 확인하고자 하였다. 그 결과, RORα-LKO 마우스 간 내 리포파고좀(lipophagosome)의 형성이 줄어들었으며 일차 배양 간세포에서 지질-특이적 자가포식 작용과 리소좀에 의한 분해 현상 또한 감소되었음을 확인하였다. RORα을 과발현하였을 때 자가포식능이 증가하였고, 이러한 현상이 mTOR의 비활성화를 통해 일어남을 확인하였다. RORα-LKO 마우스의 간에서 mTOR의 활성이 증가되어 있었다. 뿐만 아니라 RORα의 과발현을 통해 자가포식 및 리소좀 기능과 관련된 유전자 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이상의 연구 결과를 통해 핵 수용체 중 하나인 RORα가 미토콘드리아의 분열뿐만 아니라 자가포식능을 조절함으로써 비알콜성 지방간염을 완화시켰음을 확인하였다. 본 연구를 통해 핵 수용체 RORα를 미토콘드리아 기능조절인자이자 비알콜성 지방간염의 핵심 치료인자로 제시하는 바이다.

Nonalcoholic fatty liver disease ranges from simple steatosis to nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which can eventually progress to irreversible cirrhosis and to hepatocarcinoma. About 10% to 20% of patients with hepatic steatosis develop NASH, a disease stage that is characterized by increased oxidative stress and lipotoxicity and leads to cellular injury and chronic inflammation. Mitochondrial dysfunction may play a key role in the progression of steatosis to NASH; however, the molecular mechanism that controls the structure and function of mitochondria in NASH is not clearly understood. Here, I demonstrated that the orphan nuclear receptor retinoic acid-related orphan receptor α (RORα) is a regulator of mitochondrial fission and autophagy thereby contributes to mitochondrial quality control. First, I observed that liver-specific RORα knockout mice (RORα-LKO) were more susceptible to high-fat diet (HFD)-induced NASH. Results from an RNA-seq analysis combined with public ChIP-seq data (GSE59486) revealed that RORα-mediated transcription was significantly associated with electron transport chain and ATP synthesis. Concordantly, mitochondrial structure was defective, mitochondrial fission was abnormal, and the fission proteins Bnip3 and phospho-Drp1 were downregulated in the hepatocytes of RORα-LKO. RORα enhanced the oxygen consumption rate and expression of genes associated with mitochondrial quality control. Finally, I observed the positive correlation of the expression levels of Bnip3 and PGC-1α with those of RORα in patients with steatohepatitis. These results suggest that the induction of mitochondrial fission of RORα in hepatocytes can protect against development of NASH. Next, I investigated the effects of RORα on autophagy including mitophagy and lipophagy in progression of NASH. In HFD-induced NASH model, autophagosomes were less in the livers of RORα-LKO with accumulation of LC3-Ⅱ, NBR1, and lysosome-specific enzyme procathepsin D. Number of autophagic puncta co-stained with mitochondria and lipid were decreased after treatment with bafilomycin A1 in the hepatocytes of RORα-LKO. Using the ratio of mcherry-LC3 to GFP-LC3, I found that the autophagic flux was downregulated in the hepatocytes of RORα-LKO. In addition, deletion of RORα decreased co-localization of mitochondria and lipid droplets with lysosomes, suggesting decreased mitophagy and lipophagy with lysosomal defects in the hepatocytes. Overexpression of RORα in the primary hepatocytes increased autophagic flux and expression of genes associated with autophagy and lysosomal function with inactivation of mTOR pathway. In addition, mTOR pathway was activated in HFD-induced RORα-LKO mouse model. Together, I demonstrated that RORα mediates mitochondrial fission and autophagy under nutrient-overloaded conditions and propose RORα as a potential therapeutic target in treatment of NASH.