Application of ZnO nanowires for intracellular delivery of biomacromolecules and cancer immunotherapy

Abstract

Zinc oxide (ZnO) nanocomposites have been widely applied in biomedical fields due to their multifunctionality and biocompatibility. However, the physicochemical properties of ZnO nanocomposite involved in nano–bio interactions are poorly defined. To assess the potential applicability of ZnO nanowires for intracellular delivery of biomolecules, I examined the dynamics of cellular activity of cells growing on densely packed ZnO nanowire arrays with two different physical conformations, vertical (VNW) or fan-shaped (FNW) nanowires. Although a fraction of human embryonic kidney cells cultured on VNW or FNW underwent rapid apoptosis, peaking at 6 h after incubation, cells could survive and replicate without significant apoptosis on the foreign substrate after 12 h of lag phase. In addition, the cells formed lamellipodia to wrap FNW, and efficiently took up peptides non-covalently coated on VNW and FNW within 30 min of incubation. Moreover, FNW could mediate intracellular delivery of associated DNAs and their gene expression, suggesting that ZnO nanowires transiently penetrate membranes to mediate intra-nuclear delivery of exogenous DNA. These results indicate that ZnO nanowire arrays can serve as nanocomposites for manipulating nano–biointerfaces if appropriately modified in a 3-dimensional conformation. Radially grown ZnO nanowires on poly-L-lactic acid (PLLA) microfibers with the unique 3-dimensional structure were also synthesized and applied as therapeutic cancer vaccines. This inorganic-organic hybrid nanocomposite has mild cellular toxicity but efficiently delivers a tumor antigen into dendritic cells, cellular bridges between innate and adaptive immunity, to stimulate them to express inflammatory cytokines and activation surface markers. I also demonstrated that the hybrid nanocomposites successfully induce tumor antigen-specific cellular immunity and significantly inhibit tumor growth in vivo. ZnO nanowires on PLLA fibers systemically reduced immune suppressive Treg cells and enhanced the infiltration of T cells into tumor tissues, compared to mice immunized with PLLA fibers coated with the antigen. These findings open a new avenue in extending the biomedical application of inorganic metal oxide-inert organic hybrid nanocomposites as a novel vaccine platform.

산화아연(zinc oxide, ZnO) 나노복합체는 다양한 기능과 생체적합성 때문에 의공학 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 산화아연 나노복합체와 생물학적 시스템 또는 면역체계와의 상호작용 및 그 물리, 화학적 특성은 아직 잘 밝혀지지 않았다. 산화아연 나노선의 의학적 활용가능성을 알아보기 위하여, 본 연구에서는 산화아연 나노선을 커버슬립 위에 수직 형태(vertical nanowire, VNW) 혹은 부채꼴 형태(fan-shaped nanowire, FNW)로 코팅한 후, 그 위에 세포를 배양하여 각각의 세포 활성도의 변화를 측정하였다. VNW 와 FNW 산화아연 나노선에서 배양한 HEK293 세포는 배양 후 6시간까지 세포사멸이 증가하였지만, 그 후 12시간까지는 유의할 만한 세포사멸을 보이지 않으며 생존하였다. FNW에서 자란 세포는 표면을 감싸는 층상위족(lamellipodia)을 형성하였고, 나노선에 결합된 ZBP-FITC를 30분내에 효과적으로 세포내로 섭취하였다. 또한, FNW에 결합한 DNA를 세포 내로 전달하고 세포에서 단백질로 발현되는 것을 확인함으로써, FNW에 의해 외부의 DNA를 핵 내부로 전달할 수 있음을 증명하였다. 이 결과로, 산화아연 나노선 배열이 적절한 3차원 구조를 가진다면 효과적인 나노-바이오 결합체로써 작용할 수 있음을 알 수 있었다. 그에 따라, 폴리젖산 미세섬유에 산화아연 나노선을 방사형으로 자라나게 한 독특한 3차원 구조물을 합성하였고, 치료용 암 백신으로써 산화아연 나노복합체의 항-종양 면역능을 검증하였다. 이 무기물-유기물 하이브리드 나노복합체는 낮은 세포독성을 띠며, 결합된 종양 항원을 효과적으로 수지상세포 안으로 전달하고 세포가 염증성 사이토카인을 발현하게 하여, 선천면역과 적응면역을 연결하는 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 이 복합체는 항원-특이적 세포 면역을 효과적으로 유도하며, 종양의 성장을 유의하게 억제하였다. 생체 전반적인 조절 T 세포가 감소하고 종양 조직으로 T 세포의 유입이 증가하였다. 무기물-유기물 하이브리드 나노복합체를 활용하여 항암면역치료에 적용함으로써 새로운 백신 플랫폼으로의 가능성을 보였다.