Development and Analytical Validation of Clinical Assay for AFP, AFP-L3 and PIVKA-II using Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry (MRM-MS)

Abstract

Introduction: Alpha-fetoprotein (AFP), lens culinaris agglutinin-reactive fraction of alpha-fetoprotein (AFP-L3) protein induced by vitamin K absence or antagonist-II (PIVKA-II) are serum biomarkers for hepatocellular carcinoma (HCC). These markers have been measured typically by liquid-phase binding assay (LiBA). However, LiBA does not always reflect accurate concentration, due to its low analytical sensitivity. Thus, I aimed to develop an analytically sensitive multiple reaction monitoring-mass spectrometry (MRM-MS) assay to quantify AFP, AFP-L3 and PIVKA-II in serum.

Methods: The assay entailed the addition of a stable isotope-labeled internal standard protein analog into the serum, the enrichment of AFP, and prothrombin using a monoclonal antibody, the fractionation of AFP-L3 using lens culinaris agglutinin lectin, deglycosylation for AFP-L3 fractionation, trypsin digestion (AFP, AFP-L3), chymotrypsin (PIVKA-II), online desalting, and MRM-MS analysis. The performance of the MRM-MS assay was compared with that of LiBA in 400 human serum samples (100 chronic hepatitis, 100 liver cirrhosis, and 200 HCC group). Subsequently, the assays for AFP, AFP-L3 and PIVKA-II were analytically validated per the US Food and Drug Administration (FDA), European medicines agency (EMA), Korea FDA (KFDA), and Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) for clinical implementation.

Results: The lower limit of quantification (LLOQ) of the MRM-MS assay (0.051 ng/mL) for AFP, AFP-L3 was below that of LiBA. Thus, AFP-L3 values, which measured by LiBA in HCC samples (n=39), were detected by the MRM-MS assay. For PIVKA-II, the representative signature peptide was selected to measure PIVKA-II concentrations by MRM-MS. The linearity ranged from 1.28 ng/mL to 100000 ng/mL. In additions, the MRM-MS assay for AFP, AFP-L3 and PIVKA-II was validated to meet almost criteria for 12 categories (calibration curve, analytical specificity (selectivity or interference), analytical sensitivity, carryover, precision, recovery of assay, matrix effect, recovery of immunoprecipitation, dilution integrity, stability, reproducibility, and quality control (QC) of samples and frequency) to confirm whether the assay meet the international guidelines.

Conclusions: I developed methods for quantifying AFP, AFP-L3 in serum by MRM-MS-based assay that can overcome the low analytical sensitivity of LiBA. For PIVKA-II, I identified the surrogate peptide for PIVKA-II levels in human serum, and established MRM-MS assay for the first time. For the confirmation of robustness and reproducibility, the developed MRM-MS assays for AFP, AFP-L3 and PIVKA-II were validated per the US Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMA), Korea FDA (KFDA), and Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

서론: 혈액 내의AFP, AFP-L3 그리고 PIVKA-II는 간세포암의 표지자이다. 위의 3가지 단백질 표지자는 liquid-phase binding assay (LiBA)를 이용해서 정량 하는 것이 일반적이다. 그러나 LiBA는 기계 자체의 분석적인 민감도가 낮기 때문에 표지자의 농도를 정확하게 반영할 수 없다는 단점이 있다. 그러므로 우리는 질량분석기를 이용한 다중 반응 검지법을 이용하여 AFP, AFP-L3 그리고 PIVKA-II를 정량 할 수 있는 정량법을 개발 하는 것을 목표로 연구하였다.

방법: 안정 동위 원소로 표지된 재조합 단백질을 내부 표준 물질로 이용하였고, 모노클론항체를 이용하여AFP와 prothrombin을 인리치 하였고, LCA 렉틴을 이용하여 AFP-L3만을 분획하였으며 이 후, 트립신 (AFP, AFP-L3)과 키모트립신 (PIVKA-II)으로 다이제스쳔을 시행한 후 질량분석기에 주입하여 online-desalting, MRM-MS 분석을 진행하였다. 1장에서, 400명의 시료 (간염 100, 간경화 100, 간암 200)를 LiBA와 MRM-MS로 각각 분석한 후, 두 정량법의 진단적 성능을 비교하였다. 2장에서, 질량분석기 기반으로 개발된 정량법을 국제적인 가이드라인 (FDA, EMA, KFDA, CLSI)을 따라서 분석적 성능을 검증하였다.

결과: 1장에서, 개발한 MRM-MS기반의 정량법의 AFP와 AFP-L3 최저정량한계는 0.051 ng/mL로써 LiBA의 최저정량한계보다 낮았다. 따라서, LiBA로는 검출하지 못했던 39명의 간암 환자를 MRM-MS 정량법을 통해서는 검출할 수 있었다. PIVKA-II의 경우, MRM-MS로 PIVKA-II의 농도를 정량하기 위한 최적의 타겟 펩타이드를 선별하였다. 그리고 1.28 - 100000 ng/mL의 농도 구간에서 선형성을 확보하였다. 2장에서는 개발된 MRM-MS 정량법을 12가지 항목 (검량선, 분석적 특이도, 분석적 민감도, 캐리오버, 정밀도, 분석법의 회수율, 생체시료회수율, 면역침강반응의 회수율, 희석타당도, 안정성, 재현성, 품질관리시료)을 국제적인 가이드라인에 분석적 검증을 하였고, 대부분의 항목이 가이드라인의 기준에 부합하였다.

결론: 우리는 혈액 속의 AFP, AFP-L3 그리고 PIVKA-II를 정량하기 위해서 액체 크로마토그래피와 다중 반응 검지법 기반의 분석법을 개발하였고, 이 분석법은 기존의 LiBA 분석법의 낮은 민감도를 극복할 수 있다. AFP-L3의 분석적 민감도를 향상시키기 위해서 우리는 단일클론항체와 렉틴을 이용하여 AFP-L3를 분획하였고, 이 후에 탈당화와 펩타이드화를 진행하였다. PIVKA-II의 경우, 혈액속의 PIVKA-II를 질량분석기로 정량 하기 위한 타겟 펩타이드를 선별하여, MRM-MS 기반의 분석법을 개발하였다. 개발된 분석법은 국제적인 가이드라인 (FDA, EMA, KFDA, CLSI)을 따라서 분석적 검증을 완료하여 충분히 정확하고 재현성있게 정량할 수 있는 분석법인 것을 확인하였다.