Studies on inositol polyphosphates-mediated regulation of Bruton's tyrosine kinase in T cell-independent humoral immunity

Abstract

In the early stages of microbial infection, B cells immediately recognize pathogen-derived antigens to elicit robust immune responses in a T cell-independent (TI) manner. Intense and rapid TI immune response is critical for the early protection against pathogen invasion. The recognition of antigens is mediated by B cell antigen receptor (BCR) that transduces B cell-activating signals, which is essential for activating the TI humoral immunity. The regulation and activation of Bruton's tyrosine kinase (Btk) are known as a pivotal step of BCR signaling in TI humoral immunity, as observed in patients with X-linked agammaglobulinemia (XLA) experiencing a high incidence of encapsulated bacterial infections. However, key questions remain as to whether well-established canonical BCR signaling pathway, including phosphoinositide 3-kinase (PI3K) activity, is sufficient to regulate the activity of Btk. Earlier studies have suggested that the Btk activity might be regulated through mechanisms that are independent of PtdIP3 synthesis. It has been demonstrated that inositol polyphosphates are related to the regulation of Btk in in vitro assays. However, the physiological meaning of them is yet to be investigated. Here, I find that inositol polyphosphates play a critical role in TI humoral immunity. Absence of higher order inositol phosphates (InsPs), inositol polyphosphates, leads to an inability to mount immune responses against TI antigens, such as LPS or NP-Ficoll. When mice are challenged with TI antigens, the reduced cell numbers of B cells and IgM+ plasma cells are observed in the spleen of inositol polyphosphate multikinase (IPMK)-deficient mice. B cells lacking IPMK are less proliferative, and they are defective in gene expression and cytokine production upon antigenic stimulation. I have further shown that the impaired TI immune responses in IPMK-deficient mice are due to the reduced activity of Btk in B cells. The phosphorylation of Btk and its target protein, PLCγ2, upon BCR stimulation is significantly reduced in IPMK-deficient B cells. I identify inositol hexakisphosphate (InsP6) as a principal cofactor for modulating Btk activity within BCR signaling. The generation of higher order InsPs including InsP5, InsP6, and InsP7 is induced in activated B cells, but they are absent in IPMK-deficient B cells. It appears that the lack of high order InsPs results in the signaling defects in IPMK-deficient B cells. Moreover, treatment of IPMK-deficient B cells with cell permeable InsP6 efficiently restores the defects in TI immune responses, implying that InsP6 acts as an upstream regulator of Btk in BCR signaling. Interestingly, the significance of InsP6-mediated Btk regulation is more prominent in IgM+ plasma cells. Although CD19-mediated activation of PI3K is essential for functional BCR complexes, CD19 expression is markedly decreased during differentiation into IgM+ plasma cells. However, IgM+ plasma cells highly express enzymes required for the generation of high order InsPs, which might compensate for the reduced PI3K activity by increasing the level of InsP6. It seems that activation of Btk in BCR signaling is more dependent on the formation of InsP6 in IgM+ plasma cells than that in B cells. Hence, the present study identifies higher order InsPs as principal components of B cell activation upon TI antigen stimulation. These results present a novel mechanism for InsPs-mediated regulation of the BCR signaling. Findings on the role of IPMK and its products will provide a new strategy to treat disorders induced by malfunction of Btk, such as B cell malignancy, autoimmune disease, and immune deficiency, in the future.

미생물 감염의 초기 단계에서 B 세포는 즉각적으로 항원을 인식하여 T 세포 비의존적(T cell-independent) 방식으로 면역 반응을 일으킨다. 즉각적이며 강렬한 T 세포 비의존적 B 세포 면역 반응은 병원체의 감염에 대응하는 초기 방어 기제에서 핵심적인 역할을 한다. 이러한 T 세포 비의존적 B 세포 반응에서, 브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase, Btk)의 조절과 활성은 B 세포 항원 수용체(B cell antigen receptor) 신호 전달에서 중추적인 단계이다. T 세포 비의존적 B 세포 반응 과정에서 Btk의 중요성은 박테리아 감염 질병이 빈번하게 발생하는 X 연관성 무감마글로불린혈증(X-linked agammaglobulinemia) 환자의 연구를 통해서 밝혀졌다. 하지만 기존에 잘 정립된 B 세포 항원 수용체 조절 메커니즘으로 Btk의 활성 조절을 이해하기에는 부족한 부분이 남아 있다. 선행 연구결과에서 Btk의 활성이 phosphoinositide-3 kinase (PI3K) 신호 전달 경로 외 다른 방식으로 조절 받을 가능성이 보고 되었다. 특히, in vitro 실험에서 이노시톨 다인산이 Btk의 활성 조절과의 관련성이 입증되었다. 하지만 이러한 현상의 생리학적 의의는 여전히 의문으로 남아있다. 본 연구에서, 이노시톨 헥사키스인산(inositol hexakisphosphate)을 B 세포 항원 수용체 신호 전달에서 Btk의 생리적 핵심 조절 인자로 규명하였다. 이노시톨 다인산의 결핍은 T 세포 비의존적 B 세포 반응 반응의 저하를 유도하였다. T 세포 비의존적 항원을 생쥐에게 접종하였을 때, 이노시톨 다인산 멀티키나제(inositol polyphosphate multikinase, IPMK) 결핍 생쥐에서의 B 세포와 형질 세포(plasma cell)의 숫자가 줄어들었다. IPMK의 발현이 억제된 B 세포는 항원 자극에 의한 유전자 발현 및 사이토카인 생성에서 문제가 발생하였다. 이러한 IPMK 결핍 생쥐의 약화된 T 세포 비의존적 면역 반응은 Btk 활성의 저하로 인하여 유발됨을 확인 하였다. 특히, BCR 신호에 의한 Btk와 PLCγ2의 인산화가 현저히 줄어 들었다. 본 연구를 통해, 이노시톨 헥사키스인산이 B 세포 항원 수용체의 신호전달에서 Btk 활성을 유도하는 핵심 인자로 역할을 하는 것을 증명하였다. 활성화된 B 세포에서 이노시톨 다인산의 형성이 유도되지만, IPMK 결핍 B 세포에서는 형성이 억제되어 있는 것을 확인하였다. 이노시톨 다인산의 결핍이 T 세포 비의존적 면역 반응의 약화를 초래하는 것으로 추정이 된다. 뿐만 아니라, 세포막을 통과 가능한 이노시톨 헥사키스인산에 의해 IPMK 결핍 B 세포에서의 결함들이 효과적으로 회복되는 것을 확인하였다. 이는 이노시톨 헥사키스인산이 BCR 신호에서 Btk의 상위 조절 인자로 역할을 하다는 것을 의미한다. 흥미롭게도, 이노시톨 다인산을 통한 Btk 활성 조절은 IgM을 발현하는 형질 세포에서 더욱 중요한 역할을 수행한다는 것을 확인하였다. 비록 CD19에 의한 PI3K 활성은 정상 BCR 복합체의 작용에 필수적임에도 불구하고, CD19의 발현은 IgM+ 형질 세포에서 두드러지게 감소하였다. 그러나 IgM+ 형질 세포는 이노시톨 다인산의 합성에 필수적인 효소를 높게 발현하였다. 이로 인하여, 세포내 이노시톨 헥사키스인산의 증가가 줄어든 PI3K 활성을 보완할 수 있으며, 형질 세포에서 이노시톨 헥사키스인산에 의한 Btk 활성 조절의 중요성은 더욱 부각된다. 따라서, 본 연구는 T 세포 비의존적 항원에 대한 면역 반응에서 이노시톨 다인산의 역할을 규명하였다. 이러한 결과는 2 차 신호 전달 물질이 세포 작용의 방향성을 결정하는 일례로써, 이노시톨 다인산에 의한 B 세포 항원 수용체 신호 전달 조절의 새로운 메커니즘을 제시한다. IPMK와 이의 생산물의 역할에 대한 본 연구는 B 세포 종양, 자가 면역 질환, 면역 결핍과 같이 비정상적인 Btk에 의해서 발생하는 질병 치료에 대한 새로운 접근법을 제안한다.