Studies on kisspeptin neuron-specific calcium oscillation in the arcuate nucleus and the GnRH pulse generator

Abstract

맥동적으로 분비되는 시상하부의 성선자극호르몬 분비호르몬(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)은 발생과 생식 발달을 관장하는 데 중요한 인자이다. 또한 시상하부 내 궁상핵(arcuate nucleus, ARN)의 kisspeptin 신경세포는 포유류 생식 조절의 최종 공통 경로인 GnRH 신경세포를 조절하는 중요한 구성 요소로 알려져 있다. 40여년 전 신경내분비학의 시초를 열었던 GnRH의 발견 이후로 많은 연구가 진행되었지만, GnRH 맥동 발진기의 작동 기전은 여전히 밝혀지지 않았다. 특히 GnRH의 상위 조절자로 알려진 ARN kisspeptin 신경세포가 자체적으로 맥동을 발생시킬 수 있는지, 단순히 신경 정보를 전달하는 것인지, 등 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 연구는 ARN kisspeptin 신경세포의 내재적인 리듬과, 그의 신경 조절을 연구하고자 하였다. 이를 위해 Kiss1-IRES-Cre 생쥐의 두뇌 절편 배양에 유전자 재조합 칼슘 센서를 발현시키고, 실시간 형광 및 인광 이미징 장비를 이용하여 ARN kisspeptin 신경세포로부터 칼슘 역학을 관찰하였다. 또한 신경 조절 연구를 위해 약리학적 접근법을 이용하여 이온 채널 차단제, ARN kisspeptin 신경세포로부터 방출되는 신경펩타이드와 작용제, 그리고 NMDA 및 GABA 수용체 억제제를 처리하며 그 효과를 조사하였다. 특히, kisspeptin 신경세포 특이적으로 활성을 조절하기 위해 화학유전학(DREADD) 시스템을 이용하여 ARN kisspeptin 신경세포군의 칼슘 진동 발생에 대한 기여도를 관찰하였다. 끝으로, GnRH 프로모터에 의해 인광 리포터를 발현하는 생쥐의 두뇌 절편 배양을 사용하여 GnRH 맥동 발진기와의 관계를 조사하였다. ARN kisspeptin 신경세포는 두뇌 절편 배양에서 약 3분 주기의 아일주기 리듬으로 강력하고 동기화된 칼슘 진동을 나타냈다. Kisspeptin 신경세포 특이적으로 관찰된 칼슘 진동은 활동 전위에 의해 매개되는 시냅스 전달에 의존적이었고, ARN kisspeitn 신경세포에서 자가 분비되는 신경펩타이드에 의해 어느 정도 영향을 받았으며, NMDA 및 GABA 수용체에 의해 매개되는 신경 전달의 조절을 받았다. Kisspeptin 신경세포를 포함하는 두뇌 절편과 GnRH 신경세포를 포함하는 두뇌 절편의 합동 배양에서 외부 kisspeptin 처리에 의해 GnRH 유전자 발현이 동기화 되었으며, kisspeptin 수용체 억제제 처리에 의해 GnRH 유전자 발현이 부분적으로 감소하였다. 결론적으로, 본 연구는 ARN kisspeptin 신경세포가 생체 외에서 동기화되고 자체적으로 유지되는 칼슘 진동을 생성할 수 있음을 직접적으로 규명하였다. 특히 이러한 칼슘 진동이 kisspeptin 신경세포 자체를 포함하여, ARN 영역 내의 여러 요인에 의해 조절 받는다는 사실을 확인하였다. 아울러, kisspeptin을 통한 신경 전달이 GnRH 신경세포 전사 조절에 영향을 미치며, 맥동 발진기에 기여하고 있음을 제시한다.

Pulsatile secretion of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is crucial for initiating and maintaining development and reproduction. Kisspeptin neurons in the hypothalamic arcuate nucleus (ARN) appear to be essential components that control GnRH neurons, the final common pathway for central regulation of mammalian reproduction. Since the discovery of GnRH 40 years ago, considerable amount of studies on the GnRH pulse has been conducted in the field of neuroendocrinology. However, the underlying mechanisms of the GnRH pulse generator and the contribution of kisspeptin neurons are still not fully understood. Therefore, the present study aimed to examine whether ARN kisspeptin neurons can generate pulsatility. To address this, I examined the endogenous rhythmicity of ARN kisspeptin neurons and its neural regulation. Calcium dynamics from the population of individual ARN kisspeptin neurons was monitored from neonatal organotypic slice cultures of Kiss1-IRES-Cre mice transduced with genetically encoded calcium indicators, by using a real-time imaging device. Pharmacological approaches were employed to examine the effects of voltage-gated ion channel blockers, neuropeptides released from ARN kisspeptin neurons, and NMDA and GABA receptor-mediated neurotransmission inhibition. Chemogenetic approach to manipulate kisspeptin neuron-specific activity was also utilized to assess the contribution of ARN kisspeptin neurons on the population dynamics. Lastly, the relation with the GnRH pulse generator was examined using organotypic slice cultures of GnRH promoter-driven luciferase-expressing mice. ARN kisspeptin neurons exhibited a robust and synchronized calcium oscillation ex vivo, in an ultradian cycle with a period of approximately 3 min, in contrast to the irregular and desynchronized oscillations in pan-neuronal populations. Kisspeptin neuron-specific calcium oscillations were dependent on action potential-mediated synaptic transmission, marginally influenced by autocrine actions of the neuropeptides, and regulated by NMDA and GABA receptor-mediated neurotransmission. In the organotypic co-culture containing brain slices with kisspeptin and GnRH neurons, GnRH gene expression, which could be induced with exogenous kisspeptin application, was partly diminished by pharmacological blockade of kisspeptin receptor signaling. The present study demonstrated that ARN kisspeptin neurons are capable of generating synchronized and self-sustained calcium oscillation ex vivo. These calcium oscillation was regulated by multiple factors within the ARN region, including the kisspeptin neurons themselves. Moreover, the present study suggests that kisspeptin signaling have a certain role in maintaining basal GnRH gene transcription, and contributes to the GnRH pulse generator.