CRISPR-Cpf1 activation of endogenous BMP4 gene for osteogenic differentiation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells

Abstract

The CRISPR systems provide powerful genome editing tools for wide applications in biological and medical research fields. However, the safety issue due to off-target effects of CRISPR has been one of the major hindrance of its application to regenerative medicine. The conventional CRISPR system has the intrinsic danger of inducing unpredictable mutations at non-targeted genomic loci via erroneous double strand DNA breaks (DSBs). In this study, I demonstrate a safety-enhanced application of a recently discovered CRISPR-Cpf1 for targeted gene activation, without DNA double-strand break, to facilitate osteogenic differentiation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs). To this end, I developed a catalytically inactive AsCpf1 fused to tripartite transcription activator domain (dAsCpf1-VPR) that can induce up-regulation of targeted gene expression in mammalian cells. I observed that the CRISPR-dAsCpf1-VPR activator can be applied to enhance the osteogenic differentiation of human UC-MSCs, via increasing the expression level of endogenous BMP4 gene. The results suggested that the CRISPR-Cpf1 activator provides versatile methods applicable for bone regeneration and regenerative medicine.

크리스퍼(CRISPR) 시스템은 강력한 게놈 편집 기술(Genome Editing)로서 생명 및 의료 분야에 폭넓게 활용되고 있다. 하지만, CRISPR의 비특이적 효과로 인한 안전문제는 재생의학(Regenerative Medicine)에 본 기술을 활용하는 데에 있어 주요한 한계이다. 전통적인 CRISPR 시스템은 원하지 않는 게놈 위치에 DNA 절단(double strand DNA breaks, DSBs)을 유도하여 예측이 어려운 돌연변이를 유도할 잠재적 위험을 가지고 있다. 본 연구에서는 최근에 보고된 CRISPR-Cpf1을 활용해 DNA 절단 없이 유전자의 선택적 발현 증진 시스템을 제작해 안전위험을 줄이고 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)의 골분화를 향상시킬 수 있음을 보였다. 구체적으로, 본 연구에서는 AsCpf1의 핵산가수분해 기능을 비활성화시킨 뒤 세 개의 전사활성인자(VPR)를 결합시켜 동물세포에서 선택적인 내생 유전자 활성을 유도하는 dAsCpf1-VPR 시스템을 제작했다. 본 연구에서는 CRISPR-dAsCpf1-VPR 전사 활성 시스템을 통해 UC-MSC의 내생 BMP4 유전자의 발현을 증가시켜 골분화를 향상하였다. 본 결과는 CRISPR-Cpf1 전사 활성 시스템이 골재생과 재생의학을 위한 새로운 방법을 제시한다고 할 수 있다.